李 松，刘红坚，刘 欣，刘俊仙，余坤兴，卢曼曼，刘丽敏，何毅波

（广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所，广西蔗糖产业协同创新中心，广西 南宁 530007）

甘蔗开放式组织培养快繁技术研究

李 松，刘红坚，刘 欣，刘俊仙，余坤兴，卢曼曼，刘丽敏，何毅波

（广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所，广西蔗糖产业协同创新中心，广西 南宁 530007）

以浓度为1 000 mg/L次氯酸钠为抑菌剂，在甘蔗开放式组织培养条件下，对MS培养基中的无机盐、蔗糖、激素等因素进行调整试验，观察甘蔗腋芽诱导分化芽数、增殖情况等。结果表明：（1）在抑菌剂作用下，污染率高低与无机盐浓度、6-BA浓度高低不呈相关性，但污染率随蔗糖浓度的提高而提高；（2）无机盐浓度、蔗糖浓度高低对甘蔗腋芽诱导分化有影响，规律性不明显；甘蔗腋芽诱导分化率随6-BA浓度的提高而提高；（3）无机盐、6-BA、蔗糖等因素随浓度的增加对芽的繁殖有促进作用。

自1934年美国学者White等用番茄（Lycopersicume scuien-tum）根首次建立无性繁殖系以来，植物组织培养技术作为生物技术的重要组成部分，越来越受到人们的关注，时至今日，各种植物几乎都有进行组织培养的报道，该技术作为一种高效的植物快速繁殖技术显示出了巨大的应用价值。甘蔗是我国重要的糖料作物，其种植面积、产糖量均占全国总量的90%左右。甘蔗属无性繁殖作物，生长时间长、用种量大，其繁殖速度慢，大大限制了新良种的推广应用。从20世纪70年代开始，我国应用植物组培技术进行甘蔗生物快繁研究，工厂化培育甘蔗组培苗已有40 a以上的历史［1］。由于传统甘蔗组织培养要求严格的无菌环境，需要特定的仪器设备、繁杂的操作程序及技术要求，生产成本高，这大大地限制了该技术的应用和推广。为了简化组织培养程序，降低生产成本，借鉴前人［2］在荸荠［3］、白菜［4］、香蕉［5-6］、魔芋［7-9］、红豆杉［8］、梅花［10］和马铃薯［11］等植物建立的开放式组织培养技术体系，开展相关技术研究，筛选出次氯酸钠可应用于甘蔗开放式组织培养（相关研究结果已撰写论文待发表）。试验以1 000 mg/L次氯酸钠为抑菌剂，通过对培养基中蔗糖、无机盐、激素等用量进行调整，研究开放式组织培养条件下的甘蔗快繁技术，为甘蔗开放式组织培养提供较佳的组培快繁技术实践依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试甘蔗品种为新台糖22号；次氯酸钠购于南宁市精密仪器仪表有限公司，有效浓度为10%。

1.2 试验方法

试验以不同浓度的无机盐、蔗糖、激素各设3个处理，处理组的MS培养基中加入次氯酸钠溶液，浓度1 000 mg/L，分装在250 m L培养瓶中，pH值5.8；对照组MS培养基中不加次氯酸钠溶液。每个处理设3个重复，每个重复接种100个腋芽。试验培养基不经过高温灭菌，接种在相对洁净的普通实验室进行；对照培养基经过高温灭菌，消毒、接种、培养等按组织培养常规操作进行；接种后每15 d更换一次新鲜培养基，30 d观察甘蔗腋芽分化情况，60 d统计丛芽增殖生长状况。

1.2.1 无机盐浓度处理 无机盐设4个浓度处理，培养基配方为：A1：MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L；A2：1/2 MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L；A3：1/4 MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L；A4：1/8 MS +BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L；ACK：MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L。

1.2.2 蔗糖浓度处理 蔗糖设4个浓度处理，培养基配方为：B1：MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖10 g/L；B2：MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗 糖20 g/L；B3：MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗 糖30 g/L；B4：MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖40 g/L；BCK：MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L。

1.2.3 激素浓度处理 激素以6-BA进行相关浓度试验。设4个浓度处理，培养基配方为：C1：MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L；C2：MS+BA 1.5 mg/L +NAA 0.1 mg/L蔗 糖+30 g/L；C3：MS+BA 2.0 mg/L +NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L；C4：MS+BA 2.5 mg/L +NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L；CCK：MS+BA 1.0 mg/L +NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L。

1.3 观察内容及方法

1.3.1 污染率 试验材料转瓶后第3 d开始，每隔2 d调查1次，把污染瓶去掉并记录。污染率=污染瓶数/转瓶总数×100%。

1.3.2 腋芽诱导分化率 试验材料转瓶后第10 d开始，每隔4 d调查1次腋芽萌发生长情况，以腋芽萌发出新苗为准，得出腋芽诱导分化率。腋芽诱导分化率=腋芽萌发数/接种腋芽总数×100%（污染瓶数不列入统计）。

1.3.3 腋芽增殖速度 腋芽接种培养90 d后，统计每芽系（瓶）的苗数，计算腋芽增殖苗数。腋芽增殖苗数=总苗数/接种腋芽总数（污染瓶数不列入统计）。

1.4 数据分析

试验数据收集整理采用Excel表，方差分析采用DPS数据处理系统Duncan新复极差法进行。

2 结果与分析

2.1 不同无机盐浓度处理对甘蔗组培苗繁育的影响

由表1可见，在污染方面，污染率最低为ACK处理，只有4.33%，最高为A2处理，6.00%，经方差分析，各处理污染差异不显著；在甘蔗腋芽诱导分化率方面，分化率最高为ACK处理，达85.62%，其余处理从高到低依次为：A2＞A1＞A4＞A3，经方差分析，ACK与A1、A2和A4差异不显著，与A3差异达显著水平；在芽增殖方面，以ACK最多，平均每个腋芽繁殖20.2株，其次是A1，为16.5株，A2为15.3株，A4最少，只有12.9株苗，经方差分析，ACK与各处理均达极显著水平，A1与A2差异不显著，A1与A3差异达显著水平，A1与A4差异达极显著。

表1 不同无机盐浓度处理对甘蔗组培苗繁育的影响

2.2 不同蔗糖浓度处理对甘蔗组培苗繁育的影响

由表2可见，在污染方面，污染率最低为B1处理，4.00%，最高为B4处理，6.67%，经方差分析，BCK与各处理差异不显著；在甘蔗腋芽诱导分化率方面，分化率最高为B4处理，84.13%，其余处理从高到低依次为：BCK＞B2＞B1＞B3。经方差分析，BCK与B3差异达极显著水平，与其他处理差异不显著；在芽增殖方面，以BCK最多，平均每个腋芽繁殖23.7株，其次是B3，为19.5株；B1最少，只有8.2株。经方差分析，BCK与各处理差异均达极显著水平，B3、B4间差异不显著，与B1、B2差异达极显著水平。

表2 不同蔗糖浓度处理对甘蔗组培苗繁育的影响

2.3 不同激素浓度处理对甘蔗组培苗繁育的影响

由表3可见，在污染方面，污染率最低为C4处理，只有4.00%，最高为C3处理，6.00%，经方差分析各处理间差异不显著；在腋芽诱导分化率方面，分化率最高为CCK处理，87.4%，其余处理从高到低依次为：C3＞C4＞C2＞C1。经方差分析，BCK与各处理差异均达极显著水平，C3、C4间差异不显著，与C1、C2差异达极显著水平；在芽增殖方面，以CCK最多，平均每个腋芽繁殖24.1株，其次是C3，为22.8株，C1最少，只有19.6株，方差分析各处理间差异情况与腋芽诱导分化率相似。

表3 不同激素浓度处理对甘蔗组培苗繁育的影响

3 讨论与结论

培养基中的无机盐为植物组织培养过程提供必需的大量元素和微量元素，是植物细胞和组织生长必不可少的，缺少这些物质会导致生长、发育异常。无机盐浓度试验结果表明，在开放式培养中，污染率最低为对照，但对照与各处理间污染率差异不显著，说明无机盐浓度高低对污染率影响不大；对甘蔗腋芽诱导分化有影响，但没有规律性；对苗的增殖影响最大，随无机盐浓度的降低，甘蔗组培苗增殖数量而减少，且因营养不足蔗苗生长也表现出比较弱小。综合污染率、芽分化、苗增殖等因素考虑，在开放式培养中无机盐浓度以原MS基本培养基浓度为宜。

植物组织培养过程以自养为主、异养为辅的寄生型育苗过程。植物所需的碳源和能量大部分由培养基中的蔗糖提供，同时，蔗糖也是微生物孳生的主要原因。试验结果表明，蔗糖浓度为1%时污染率最低，随着蔗糖浓度的提高，污染率有上升的趋势，研究结果与吴桂容等［3］在荸荠的开放式组织培养中相似。蔗糖浓度的高低对芽分化有一定的影响，但影响差异不大，其原因可能是接的芽组织较大，自身携带有一定的营养物质供其在分化过程中利用；虽然随着蔗糖浓度的提高其污染率升高，但其芽繁殖数也随之升高，3%的蔗糖浓度有利于甘蔗繁殖，结果与赵青华等［9］在磨芋的开放式组织培养中研究相似。综合污染率、芽分化、苗增殖等因素考虑，在开放式培养中蔗糖浓度以3%较适宜。

组织培养中不同植物所需的激素的种类和浓度不同；同一植物，不同的培养阶段其所需的激素的种类和浓度也不同。在甘蔗组培快繁中，常用的激素种类相对简单，愈伤组织脱分化为2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）、愈伤组织再分化与组培苗增殖为6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）与NNA（萘乙酸）、生根培养为NAA。试验中以甘蔗腋芽为供体，所用激素为6-BA与NNA，试验只对6-BA进行不同浓度处理。结果表明，6-BA浓度高低与污染率高低无关；随6-BA浓度的增加，腋芽诱导分化率与苗的增殖数量芽增殖等相应提高。由于未设置太多的激素组合处理，试验结果仅供参考。综合污染率、芽分化、苗增殖等因素考虑，在开放式培养中6-BA浓度以1.5～2.0 mg/L较适宜。

植物开放式组织培养技术对环境无严格的无菌要求、操作程序简化，成本降低，是未来植物组织培养发展的主要方向。试验中添加的次氯酸钠，虽然对组织培养过程中的微生物生长有较好的抑制作用，实现了开放式培养；但同时，次氯酸钠对甘蔗组培苗的繁育也有抑制作用，与传统培养方式相比，在培养基中添加抑菌剂繁育的甘蔗组培苗较弱。

综上所述，在MS+BA 1.5～2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/ L+蔗糖30‰+次氯酸钠1 000 mg/L的培养基中，腋芽繁殖速度较快，可在甘蔗开放式组织培养中使用；但腋芽增殖速度与组培苗素质仍低于对照。因此，筛选出既能抑菌又不影响外植体生长的抑菌剂是植物开放式组织培养技术的核心，也是开放式培养在生产中成功应用的前提。

［1］ 恽 绵. 我国甘蔗组织培养工厂化育苗技术的应用与展望［J］. 甘蔗糖业，1989，（2）：13-15.

［2］ 张 慎，郭陶然，邓志瑞，等. 植物开放式组织培养的研究进展［J］.安徽农业科学，2010，38（26）：14281-14283，14288.

［3］ 吴桂容，曲芬霞，余炳锋. 贺州荸荠开放式组织培养体系建立［J］.北方园艺，2013，（6）：110-112.

［4］ 王赵玉，张健雄，户新宇，等. 抑菌剂在开放式植物组织培养中的应用研究［J］. 北方园艺，2012，（18）：125-127.

［5］ 黄泰达，莫廷辉. 香蕉开放式组织培养中增殖培养基成分优化研究［J］. 安徽农业科学，2012，40（18）：9584-9586.

［6］ 解 辉，莫廷辉，曾丽星. 次氯酸钠在香蕉开放式组织培养中的应用研究［J］. 热带作物学报，2011，32（5）：886-890.

［7］ 赵青华，陈永波，滕建勋，等. 开放式组织培养下魔芋快繁技术研究［J］. 现代农业科技，2011，（13）：114-115.

［8］ 王 丹，刘 霞. 山梨酸钾在红豆杉开放式组织培养中的应用［J］.安徽农业科学，2010，38（2）：634-635.

［9］ 赵青华，陈永波，杨朝柱，等. 魔芋开放式组织培养技术初探［J］.氨基酸和生物资源，2009，31（4）：79-82.

［10］ 陈瑞丹，孙文薇. 梅花品种“淡丰后”茎段开放式启动培养的初步研究［J］. 北京林业大学学报，2007，29（S1）：30-34.

［11］ 张薪薪，唐金花，王关林. 抑菌剂在开放组培中的使用及效果研究［J］. 辽宁师范大学学报（自然科学版），2005，28（4）：466-469.

（责任编辑：夏亚男）

Technology Research of Open Tissue Culture for Sugarcane Rapid Propagation

LI Song，LIU Hong-jiang，LIU Xin，LIU Jun-xian，YU Kun-xin，LU Man-man，LIU Li-m in，HE Yi-bo
（The Sugarcane Research Institute， GXAAS， Collaborative Innovation Center of Sugarcane Industry， Nanning 530007， PRC）

Under the condition of open tissue culture with 1000 mg/L sodium hypochlorite as bacteriostatic agent， the MS composition of inorganic salt， sucrose， hormone， etc. were tested by instigation of sugarcane axillary bud differentiation， proliferation， etc.. The results showed that： （1） pollution rate was not signif cant among concentrations of inorganic salt and the 6-BA and signif cant among sucrose concentrations with the increase of sucrose concentration. （2） The sugarcane axillary bud differentiation was affected by the concentration of inorganic salt， sucrose without regularity and increased with 6-BA concentration increased. （3） The shoot propagation increased with concentration increased of inorganic salts， 6-BA and sucrose. It was concluded that with medium of MS +1.5-2.0 mg/L BA + 0.1mg/L NAA + 30‰ sucrose +1 000 mg/L sodium hypochlorite， the axillary bud propagation was faster and can be used in the sugarcane open tissue culture. However， the proliferation rate and the shoot quality were lower than controls.

sugarcane； open tissue culture； rapid propagation

S566.1；Q943.1

A

1006-060X（2016）09-0001-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.09.001

2016-06-20

广西自然科学基金项目（2014GXNSFAA118090）；广西农业科学院科技发展基金项目（2015JZ06）

李 松（1964-），男，广西博白县人，研究员，研究方向：甘蔗生物技术、诱变育种与栽培。

可见，在MS+BA 1.5～2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30‰+次氯酸钠1 000 mg/L的培养基中，腋芽繁殖速度较快，可在甘蔗开放式组织培养中使用；但腋芽增殖速度与组培苗素质仍低于对照。关键词：甘蔗；开放式组培；快繁技术