付金玲　曲志刚　左　玲　宋　丹　康治臣

(吉林大学第二医院眼科，吉林　长春　130041)



年龄对斑马鱼视网膜光感受器细胞密度的影响

付金玲曲志刚1左玲宋丹康治臣2

(吉林大学第二医院眼科，吉林长春130041)

目的探讨年龄对斑马鱼视网膜光感受器细胞密度的影响。方法利用JB-4福尔根组织学方法观察和检测3、15、27个月野生型斑马鱼视网膜不同区域、不同种类光感受器细胞的密度。结果随斑马鱼年龄增长，在视网膜各个区域所有种类的光感受器细胞密度均逐渐下降。视网膜光感受器细胞密度总体区域性变化趋势是：中央区细胞密度最大，从中央区到周边区细胞密度逐渐下降。结论视网膜光感受器细胞密度在年龄和区域上均有一定的变化规律。在正常老龄化进程中，光感受器细胞密度的下降贯穿于整个视网膜之中。

斑马鱼；视网膜；光感受器细胞

斑马鱼视网膜光感受器细胞占所有视网膜细胞总数的70%左右，在一些以光感受器细胞退变为主的视网膜疾病研究上具有独特优势〔1〕。光感受器细胞主要分为视杆细胞和视锥细胞〔2〕。视锥细胞依据它们对光谱的最大敏感度可以进一步分为四种类型，分别对紫外光(UV)及红光、绿光、蓝光(RGB) 敏感〔3〕。本文拟研究不同年龄野生型斑马鱼视网膜光感受器细胞密度的动态变化。

1　材料与方法

1.1动物饲养AB野生型斑马鱼在14 h光照/10 h黑暗交替循环的恒温鱼房内进行培育饲养。

1.2方法

1.2.1JB-4福尔根组织学检查分别固定3、15、27个月野生型斑马鱼双眼眼球于4%多聚甲醛溶液中，常温过夜。将固定后的标本进行梯度酒精脱水，并将标本及JB-4混合液放置于包埋模具(JB-4包埋试剂盒，Polysciences公司)内。将包埋后的眼组织标本用超薄切片机(Thermo Electron公司)经过前-后以及腹-背两个方向进行切割。每个切片的厚度是3 μm。在常温下将切片浸泡于3 N盐酸中过夜，将染色后的切片在蒸馏水中浸泡10 min。在常温下将切片在Schiff试剂(Santa Cruz公司)中浸泡2 h，用流水冲洗30 s，再在蒸馏水中浸泡5 min。经过洗涤后的切片在常温下进行干燥，中性树胶封片。

1.2.2光感受器细胞观察及计数在奥林巴斯BX60显微镜UplanApo 20×/0,80油镜下观察结果，所有图像均在同一暴露时间下应用4.6版Spot软件(Diagnostic Instruments公司)进行拍摄。将经过眼球前-后及腹-背两个方向切割并经福尔根染色后拍摄的完整视网膜图像分为周边区、旁中央区及中央区。依据此分区方法将视网膜共分为九个区域进行细胞计数：前周边区、前旁中央区、中央区、后旁中央区、后周边区、腹周边区、腹旁中央区、背旁中央区及背周边区。

1.3统计学方法每个样本选取平行于视网膜细胞层延伸200 μm长度范围内的区域计数三类细胞视杆细胞、UV视锥细胞以及RGB视锥细胞。每个样本选取经过连续切割的三张切片，分别对视网膜的各个区域各类细胞进行计数后取它们的算数平均值进而获得每个样本的细胞密度。再计算所有相同年龄斑马鱼视网膜各个区域各类细胞密度的算数平均值，从而最终获得各年龄斑马鱼视网膜不同区域不同种类细胞的细胞密度。应用SPSS19.0软件进行配对t检验。

2　结　果

2.1视网膜光感受器细胞密度随年龄增长逐渐下降随斑马鱼年龄增长，在视网膜各个区域所有种类的光感受器细胞密度均逐渐下降。以中央区为例，27个月较3个月斑马鱼视网膜三类光感受器细胞密度均显著下降(P<0.05)。其中，视杆细胞密度下降9%，UV视锥细胞密度下降30%，RGB视锥细胞密度下降34%。在视网膜其他8个区域，27个月较3个月斑马鱼视网膜三类光感受器细胞密度也均显著下降(P<0.05)。见表1。

2.2视网膜光感受器细胞密度的区域性变化以15个月斑马鱼为例，按照中央-旁中央-周边方向分别在前部、后部、腹部及背部四个区域进行细胞密度比较。以背部区为例，旁中央区三类光感受器细胞密度比旁中央区增加51%～64%，旁中央区三类光感受器细胞密度比周边区增加14%～19%。在其他三个区域内细胞密度也存在相似的变化趋势。3个月和27个月斑马鱼视网膜光感受器细胞密度在四个区域存在相似的变化趋势。视网膜光感受器细胞密度总体区域性变化趋势：中央区细胞密度最大，从中央区到周边区细胞密度逐渐下降。见表1，图1。

表1　3、15、27个月斑马鱼视网膜光感受器细胞密度±s,个)

图1　15个月视网膜光感受器细胞密度的区域性变化

3　讨　论

野生型斑马鱼视网膜光感受器细胞密度在各个区域随年龄增长的变化趋势说明：在正常老龄化进程中，所有类型的视网膜光感受器细胞密度均逐渐下降，这种下降贯穿于整个视网膜之中。这种随年龄增长细胞密度下降的变化趋势考虑是由于野生型斑马鱼随着眼球发育视网膜逐渐变长，视网膜延长使细胞分布变得稀疏，同样区域内细胞密度减少。考虑到斑马鱼视网膜独特的神经再生特点〔4～6〕，细胞下降数目可能会更多。视网膜光感受器细胞的密度同时存在区域性变化规律。在生长早期，视网膜光感受器细胞发育从周边部开始，逐渐向中央区及两侧延伸，最终形成特殊的正态分布规律：视网膜中央区细胞密度最大，从中央区到周边区细胞密度逐渐下降。这种光感受器细胞密度在年龄和区域上变化规律的发现有助于进一步研究视网膜的发育机制。斑马鱼的视网膜光感受器细胞以视锥细胞为主〔7～9〕，是研究以光感受器细胞退变为主要病变机制的视网膜退行性疾病的极佳模式动物〔1〕。掌握正常视网膜光感受器细胞密度随年龄增长的变化规律可以为研究视网膜退变提供必要的基础数据。通过本文视网膜视锥细胞随年龄增长逐渐死亡，特别是到晚期视锥细胞大量死亡的研究结果可以进一步揭示人类年龄相关性黄斑变性、Leber先天性黑矇以及视网膜色素变性的发病机制。

1Szamier RB,Berson EL.Retinal ultrastructure in advanced retinitis pigmentosa〔J〕.Invest Ophthalmol Vis Sci,1977;16(10):947-62.

2Nawrocki L,Bremiller R,Streisinger G,etal.Larval and adult visual pigments of the zebrafish,Brachydanio rerio〔J〕.Vision Res,1985;25(11):1569-76.

3Robinson J,Schmitt EA,Harosi FI,etal.Zebrafish ultraviolet visual pigment:absorption spectrum,sequence,and localization〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,1993;90(13):6009-12.

4Fernald RD.Teleost vision:seeing while growing〔J〕.J Exp Zool Suppl,1990;5:167-80.

5Marcus RC,Delaney CL,Easter SS Jr.Neurogenesis in the visual system of embryonic and adult zebrafish(Danio rerio)off〔J〕.Vis Neurosci,1999;16(3):417-24.

6Otteson DC,D'Costa AR,Hitchcock PF.Putative stem cells and the lineage of rod photoreceptors in the mature retina of the goldfish〔J〕.Dev Biol,2001;232(1):62-76.

7Curcio CA,Sloan KR,Kalina RE,etal.Human photoreceptor topography〔J〕.J Comp Neurol,1990;292(4):497-523.

8Bilotta J,Saszik S,Sutherland SE.Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish〔J〕.Dev Dyn,2001;222(4):564-70.

9Doerre G,Malicki J.Genetic analysis of photoreceptor cell development in the zebrafish retina〔J〕.Mech Dev,2002;110(1-2):125-38.

〔2016-01-22修回〕

(编辑袁左鸣)

国家自然科学基金资助项目(81400433);吉林大学白求恩计划资助项目(2015306);吉林大学优秀青年教师培养计划资助项目(419080500588)

康治臣(1978-)，男，主治医师，主要从事神经、骨骼系统疾病康复及神经电生理研究。

付金玲(1981-)，女，主治医师，主要从事退变性视网膜病变机制研究。

R774.1

A

1005-9202(2016)16-3893-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.010

1吉林大学第一医院脊柱外科2吉林大学第二医院康复科