陈　果　李　蔚　李小惠

(四川省医学科学院 四川省人民医院，四川　成都　610072)



鸦胆子苦醇抑制人非小细胞肺癌A549细胞转移的机制

陈果李蔚李小惠

(四川省医学科学院 四川省人民医院，四川成都610072)

目的探讨鸦胆子苦醇对人非小细胞肺癌A549细胞转移能力的抑制作用及其机制。方法采用Reed-Muench法计算鸦胆子苦醇对A549细胞的半数致死浓度(LC50)；通过CCK-8测定细胞活力绘制增殖曲线和流式细胞周期测定鸦胆子苦醇对A549细胞增殖能力的影响；采用Transwell法检测鸦胆子苦醇对A549细胞株转移的抑制情况，以及在半数致死浓度的鸦胆子苦醇浓度下不同时间对细胞转移的抑制率；应用Western印迹法检测细胞转移相关蛋白的表达情况。结果非小细胞肺癌A549细胞的增殖能力在鸦胆子苦醇处理后基本没有变化；鸦胆子苦醇处理后A549细胞的转移能力与对照组相比明显下降，且在一定作用时间范围内有时间依赖性；肿瘤转移相关蛋白(BRF)2、胰岛素样生长因子结合蛋白-2(IGFBP-2)、CD151的表达水平在鸦胆子苦醇处理后的细胞中明显下调。结论鸦胆子苦醇是潜在的抗非小细胞肺癌的药物，有必要进一步阐明其抗非小细胞肺癌的分子机制，为临床治疗提供一定的指导意义。

鸦胆子苦醇；非小细胞肺癌；A549细胞；转移

随着当今分子生物学技术和临床治疗水平的快速发展，非小细胞肺癌的临床治疗手段特别是新型的分子药物靶向治疗有了较明显的进步，但是肺癌的易转移性仍然是治疗的主要难题〔1，2〕。鸦胆子苦醇(Brusatol)是一种苦木内酯类化合物，从鸦胆子中提取获得。鸦胆子性苦寒，具有杀虫止痢和抗疟、抗肿瘤等功效〔3〕。目前关于鸦胆子苦醇抗白血病、抗胰腺癌和前列腺癌中的重要作用均有报道，但未见有其对肺癌转移能力抑制的研究〔4〕。本文初步探讨鸦胆子苦醇对非小细胞肺癌A549细胞转移的抑制能力及其相应的分子机制。

1　材料与方法

1.1试验药物鸦胆子苦醇，购自成都植标化纯生物技术有限公司。

1.2试剂非小细胞肺癌A549细胞，购自中科院上海细胞所。胆囊收缩素八肽(CCK-8)，购自上海易色医疗科技有限公司；24孔，孔径8.0 μm，Transwell板，购自北京乐博生物科技有限公司；1640培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司；0.25%胰蛋白酶购自美国Gibco公司；肿瘤转移相关蛋白2(BRF2)、胰岛素样生长因子结合蛋白-2(IGFBP-2)、CD151、β-actin单克隆抗体购自Proteintech公司；辣根过氧化酶标记的羊抗兔、羊抗鼠抗体购自北京中杉金桥。

1.3仪器倒置相差显微镜：德国Leica 公司；二氧化碳孵箱：美国Thermo Fisher 公司；垂直电泳系统、蛋白转印系统：北京六一；无菌操作台：苏净集团安泰公司；凝胶成像系统：美国Bio-Rad公司。

1.4方法

1.4.1细胞培养A549细胞用5 ml含10%胎牛血清(FBS)的1640培养基于含37℃、饱和湿度、5%CO2的恒温培养箱中培养，细胞呈单层贴壁生长，后续实验取状态良好的对数期细胞进行。

1.4.2半数致死浓度计算将生长状态良好的对数期细胞按2 000个/孔的细胞量接种于96孔板中，鸦胆子苦醇用无血清培养基稀释，按0.01～10 μmol/L十倍稀释设置浓度梯度，每孔加100 μl。于培养箱中孵育，2 d后观察细胞生长状态，细胞发生坏死标记为阳性，细胞未有坏死标记为阴性。统计数据，用Reed-Muench算法进行计算。

1.4.3细胞增殖能力测定A549细胞经半数细胞致死浓度的鸦胆子苦醇处理6 h和12 h后胰酶消化，按每孔2 000个细胞的量接种于96孔板中，用CCK-8法分别测定0、1、2、3、4、5 d的吸光值，数据绘制成曲线图。半数细胞致死浓度的鸦胆子苦醇处理A549细胞6 h和12 h后胰酶消化，按每组样品2×106的量收集细胞于EP管中，75%乙醇固定过夜，用含100 μg/ml RNA酶、30 μg/ml PI和2‰的TritonX-100染液染色，细胞流式仪分析，用ModFit处理数据。

1.4.4细胞转移能力的测定A549细胞经半数细胞致死浓度的鸦胆子苦醇分别处理2、6、12、24、48 h后用胰酶消化收集细胞，每个样品孔200 μl，无血清1640培养基重悬5×104个细胞于Transwell上室中，下室采用含20%FBS的1640培养基900 μl，恒温培养箱中孵育24 h，用棉签擦去上室残留细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，甲醇中固定30 min，室温吹干，用结晶紫染色1 min，PBS清洗，将上室薄膜用小刀切下，于载玻片上，固定，封片，观察计数。

1.4.5Western印迹检测细胞内转移相关蛋白表达上步骤中同批次细胞，经PBS清洗后，加入RIPA细胞裂解液，冰上裂解细胞30 min，12 000 r/min离心10 min，用考马斯亮蓝染色法进行蛋白质浓度测定。同样量的蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳进行蛋白分离，蛋白电泳完成后通过蛋白转印系统将PAGE胶上的蛋白转印到适当大小的硝酸纤维素膜上，用5%的脱脂奶粉进行封闭，按1∶1 000的稀释倍数配置抗体，4℃孵育过夜，第2天取出后洗去残余的一抗，按1∶5 000的稀释倍数配置二抗，室温孵育2 h后洗去残余的二抗，用增强化学发光法(ECL)显色，对比转移相关蛋白表达变化。

1.5统计学方法应用SSPS17.0和Graphpad prism 5统计软件进行处理。

2　结　果

2.1梯度浓度鸦胆子苦醇处理A549细胞观察细胞生长状态，采用Reed-Muench算法计算得出半数致死浓度为(0.70 ± 0.06)μmol/L。0.01μmol/L浓度的鸦胆子苦醇处理A549细胞后细胞生长状态良好，10 μmol/L浓度的鸦胆子苦醇处理A549细胞后细胞多数发生坏死。见图1。

2.2CCK-8实验结果半数致死浓度的鸦胆子苦醇处理A549细胞6 h和12 h后，与未处理前相比其增殖能力没有明显变化；细胞流式周期分析结果显示，半数致死浓度的鸦胆子苦醇处理A549细胞6 h和12 h后与未处理前相比其细胞周期变化不明显。见图2，图3。

2.3Transwell实验结果0.70 μmol/L的鸦胆子苦醇处理A549细胞6 h后，A549细胞的转移能力略有下降；处理12 h后，细胞的转移能力明显下降。见图4。

图1　A549细胞生长状态(×200)

图2　A549细胞增殖曲线图

A：对照组；B：鸦胆子苦醇处理处理6 h；C：鸦胆子苦醇处理处理12 h；下图同图3　A549细胞周期

图4　0.70 μmol/L的鸦胆子苦醇处理A549细胞不同时间细胞迁移能力(×200)

2.4Western印迹检测结果细胞转移相关蛋白BRF2、IGFBP-2、CD151的表达水平均有不同程度的下调。与细胞转移能力相应，在鸦胆子苦醇处理6 h后蛋白表达量开始下降，在12 h后蛋白表达明显下调。见图5。

图5　鸦胆子苦醇处理A549细胞不同时间段细胞转移相关蛋白的表达

3　讨　论

目前发现，天然抗肿瘤药物通过不同的作用方式抑制肿瘤生长，如抑制肿瘤细胞的增殖；或者通过诱导肿瘤细胞的分化而使肿瘤细胞失去干性；诱导肿瘤细胞的凋亡以及抑制肿瘤细胞的黏附能力从而抑制肿瘤的迁移、侵袭和浸润转移等。本研究发现，鸦胆子苦醇能够抑制非小细胞肺癌A549细胞的迁移能力，而且在一定范围内药物对肿瘤细胞迁移能力抑制的效果具有时间和剂量依赖性。半数致死浓度(0.70 μmol/L)的鸦胆子苦醇处理A549细胞后其迁移能力发生明显下降，进一步检测发现鸦胆子苦醇可能通过调节细胞内迁移相关蛋白的表达而影响细胞的迁移。

在肿瘤细胞的侵袭转移过程中肿瘤微血管网络的形成对转移的进程起着非常关键的作用。肿瘤中微血管网络的存在不仅能够为肿瘤细胞的生长提供丰富的营养物质，而且能够促进肿瘤细胞的迁移和侵袭，为肿瘤细胞的转移提供必要的通道〔5〕。肺癌组织内的微血管极为丰富，造成其更易发生侵袭与转移，这也是目前肺癌治疗困难的主要原因之一。因此，研究肺癌肿瘤组织中微血管网络的形成机制，并针对其相应的机制采取有效的干预措施，能够抑制肺癌中微血管网络的形成，进而降低肺癌细胞的侵袭和转移能力，从而在一定程度上降低肺癌的死亡率。

本研究发现鸦胆子苦醇能够下调细胞中IGFBP-2的表达。IGFBP-2是属于胰岛素样生长因子家族的蛋白成员之一，能通过与胰岛素生长因子(IGF)相互作用而发挥其生物学功能〔6〕。已有研究证实非小细胞肺癌组织中IGFBP-2的表达有明显的上调，而且其与非小细胞肺癌肿瘤的侵袭转移能力密切相关〔7〕。BRF2主要参与RNA聚合酶Ⅲ催化的miRNA的产生。BRF2基因与miRNA的相互关系决定了其在肿瘤发生、发展中所起的重要作用〔8〕。研究表明BRF2基因在肺鳞癌的发生发展过程中扮演着重要的角色，与肿瘤的侵袭转移等过程存在密切的关系〔9〕。CD151是四跨膜蛋白(TM4SF)家族的成员之一〔10〕，主要参与调控信号传导，细胞的激活、发展、增殖和运动、肿瘤侵袭与转移等多种生物学功能〔11，12〕。临床研究表明，CD151蛋白在多种人类常见的恶性肿瘤中表达水平均有一定上调，且与这些肿瘤的预后关系紧密〔13〕。这与本研究发现非小细胞肺癌A549细胞中CD151蛋白的表达也受鸦胆子苦醇的影响相符合。

综上所述，鸦胆子苦醇通过调节细胞内转移相关蛋白的表达而对非小细胞肺癌的转移能力有明显的抑制作用。鸦胆子苦醇可以作为潜在的治疗非小细胞肺癌的中成药物，为肺癌的临床治疗提供一定的指导意义。

1Johnson DH，Schiller JH，Bunn PA Jr.Recent clinical advances in lung cancer management〔J〕.J Clin Oncol，2014；32(10)：973-82.

2Rao JS，Gondi C,Chittivelu S,etal.Inhibition of invasion，angiogenesis，tumor growth，and metastasis by adenovirus-mediated transfer of antisense uPAR and MMP-9 in non-small cell lung cancer cells〔J〕.Mol Cancer Ther，2005；4(9)：1399-408.

3Olayanju A，Copple IM，Bryan HK，etal.Brusatol provokes a rapid and transient inhibition of Nrf2 signaling and sensitizes mammalian cells to chemical toxicity—implications for therapeutic targeting of Nrf2〔J〕.Free Radic Biol Med，2015；78(2)：202-12.

4Cuendet M，Gills JJ，Pezzuto JM.Brusatol-induced HL-60 cell differentiation involves NF-kappaB activation〔J〕.Cancer Lett，2004；206(1)：43-50.

5Hanrahan V，Currie MJ，Gunningham SP，etal.The angiogenic switch for vascular endothelial growth factor(VEGF)-A，VEGF-B，VEGF-C，and VEGF-D in the adenoma-carcinoma sequence during colorectal cancer progression〔J〕.J Pathol，2003；200(2)：183-94.

6Park K，Gad E，Goodell V，etal.Insulin-like growth factor-binding protein-2 is a target for the immunomodulation of breast cancer〔J〕.Cancer Res，2008；68(20)：8400-9.

7Lu H，Wang L，Gao W，etal.IGFBP2/FAK pathway is causally associated with dasatinib resistance in non-small cell lung cancer cells〔J〕.Mol Cancer Ther，2013；12(12)：2864-73.

8Cabarcas S，Schramm L.RNA polymerase Ⅲ transcription in cancer：the BRF2 connection〔J〕.Mol Cancer，2011；10(1)：1-10.

9Lockwood WW，Chari R,Coe BP，etal.Integrative genomic analyses identify BRF2 as a novel lineage-specific oncogene in lung squamous cell carcinoma〔J〕.PLoS Med，2010；7(7)：e1000315.

10Caplan M,Kamsteeg EJ,Ouffield A.Tetraspan proteins：regulators of renal structure and function〔J〕.Curr Opin Nephrol Hypertens，2007；16(4)：353-8.

11Levy S，Shoham T.Protein-protein interactions in the tetraspanin web〔J〕.Physiology，2005；20(2)：218-24.

12Fedor B，Elena O.Tetraspanins as regulators of protein trafficking〔J〕.Traffic，2007；8(2)：89-96.

13Yue S，Mu W，Zöller M.Tspan8 and CD151 promote metastasis by distinct mechanisms〔J〕.Eur J Cancer，2013；49(13)：2934-48.

〔2015-10-12修回〕

(编辑袁左鸣)

The inhibitory effects of brusatol on the migration of human non-small cell lung carcinoma A549 cells and its molecular mechanism

CHEN Guo,LI Wei,LI Xiao-Hui.

Sichuan Provincial People's Hospital,Chengdu 610072,Sichuan,China

ObjectiveTo explore the inhibitory effects of brusatol on the migration of human non-small cell lung carcinoma A549 cells and its molecular mechanism.MethodsReed-Muench method was used to calculate the lethal concentration of 50%(LC50) of brusatol on A549 cell.Transwell method was used to detect the inhibitory effect of A549 cell lines migration after deal with brusatol,and different inhibition rate of migration with different concentration of brusatol.Western blot was used to detect the expression of cell metastasis associated proteins.ResultsThe migration of A549 cell was down-regulated compared with that of control group after dispose with brusatol.Cell metastasis associated proteins BRF2,IGFBP-2 and CD151 were obviously reduced expressions in cell after dispose with brusatol.ConclusionsHrusatol is a potential anticancer drug against the non-small cell lung carcinoma,the further molecular mechanism should be revealed to provide significance guiding for clinical treatment.

Brusatol;Non-small cell lung carcinoma;A549 cell;Migration

国家“973”计划项目(No.2011CB708133)；四川省科技厅项目(No.2015SZ0042)

李蔚(1966-)，女，主任医师，主要从事肺癌、COPD等疾病的治疗及机制研究。

陈果(1981-)，女，硕士，主要从事非小细胞肺癌的治疗及其相关机制研究。

R736

A

1005-9202(2016)16-3897-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.012