李晨光　刘　菲　张凤香

(锦州医科大学附属第一医院脑外科，辽宁　锦州　121001)



钙敏感受体对巨噬细胞内胱硫醚-γ-裂解酶表达的调控

李晨光刘菲张凤香

(锦州医科大学附属第一医院脑外科，辽宁锦州121001)

目的研究钙敏感受体(CaR)是否通过增强钙调蛋白(CaM)的表达提高胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)的活性，进而抑制巨噬细胞向泡沫细胞的转化。方法Western印迹法检测各组细胞中CSE、PI3K和p-AKT的表达；敏感硫电极法检测巨噬细胞中H2S含量的变化；油红O染色检测阳性细胞的相对含量；HPLC测定细胞内胆固醇含量。结果与空白对照组比较，GdCl3组明显增强CSE的表达，而PI3K和p-AKT的表达被明显抑制；CaM抑制剂U73122组和GdCl3+U73122组PI3K和p-AKT的表达明显增强，而CSE的表达被明显抑制。敏感硫电极法检测H2S的相对含量结果显示：与空白对照组比较，GdCl3组作用泡沫细胞48 h后H2S的相对含量明显增加；而U73122组和GdCl3+U73122组H2S的相对含量明显降低。油红O染色检测和HPLC检测结果显示：与空白对照组比较，GdCl3组作用泡沫细胞48 h后，巨噬细胞泡沫化程度明显降低，而U73122组和GdCl3+U73122组巨噬细胞泡沫化程度均明显增加。结论CaR可以通过增强CaM的表达激活细胞内CSE的活性，进而抑制巨噬细胞向泡沫细胞转化。

钙敏感受体；钙调蛋白；胱硫醚-γ-裂解酶

研究显示〔1〕，硫化氢(H2S)/胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)对心血管疾病(如动脉粥样硬化)的发展具有拮抗作用，可抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖、抑制新生内膜形成、抑制泡沫细胞形成等〔2，3〕。但CSE/H2S体系抑制动脉粥样硬化形成的具体机制尚不十分清楚。钙调蛋白(CaM)是细胞内Ca2+的重要受体，研究表明〔4〕，细胞内钙增加可以活化CaM活性，然后通过活化的Ca2+/CaM通路对CSE的活性进行调节，从而调控H2S的生成，最终影响动脉粥样硬化的形成。研究已经证实〔5〕，钙敏感受体(CaR)在巨噬细胞内不仅存在表达，而且还能够通过G蛋白-PLC-IP3通路引起内质网释放Ca2+，进而增加细胞内Ca2+。Kamano等〔6〕报道，提高Ca2+可增加外周血中单核细胞的化学趋向性。此外，细胞内钙的增加可以活化CaM的活性，然后通过活化的Ca2+/CaM通路抑制动脉粥样硬化的形成。

我们前期研究证明，CaR可以通过增强巨噬细胞内CSE的表达促进H2S的分泌，进而抑制动脉粥样硬化的形成。本文主要探讨CaR是否能通过CaM促进巨噬细胞内CSE的表达，从而促进H2S的分泌，抑制动脉粥样硬化的形成。

1　材料与方法

1.1细胞及主要试剂CaM抑制剂U73122购自美国Sigma公司；THP-1人单核巨噬细胞购自中国科学院上海生命科学研究院；CaR激动剂GdCl3购自上海生物工程有限公司；人氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)购于北京协生生物科技有限责任公司；ECL发光试剂盒购自康为世纪公司。BCA蛋白含量检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。

1.2实验方法①细胞培养、处理及分析：THP-1人单核巨噬细胞置于5% CO2、37℃饱和湿度的恒温培养箱中培养，浓度控制在106/ml，每2 d换液一次，细胞呈上皮样贴壁生长。待细胞增长至80%～90%时，用0.25%胰蛋白酶消化1～2 min 后传代，倒置显微镜下观察细胞形态。每隔3～5 d传代一次，取传代后巨噬细胞，加入终浓度为80 mg/L的ox-LDL，共同孵育48 h，即得泡沫细胞模型。将诱导的泡沫细胞分为4组：空白对照组；GdCl3(10 μg/ml)组；GdCl3+U73122(30 μg/ml)组；U73122(30 μg/ml)组，分别培养48 h，收集细胞。②H2S的检测：取各组培养48 h的细胞上清液，采用敏感硫电极法进行检测，敏感硫电极(Pag/S1上海雷磁)。③细胞油红O染色：各组细胞分别培养48 h后，经过PBS反复冲洗，10%甲醛固定，新过滤的油红O染色细胞10 min，苏木精明矾染液染色5 min，封片封固。光学显微镜下观察细胞油红O染色阳性率。④HPLC分析：收集细胞，弃上清，NaCl 500 μl重悬细胞，离心机离心，蛋白定量检测。经过己烷混合烘干后沉淀。再经异丙醇、乙腈溶解，离心后收集上清液，测定胆固醇酯(CE)、游离胆固醇(FC)和总胆固醇(TC)的含量。⑤Western印迹检测：收集细胞，提取总蛋白，SDS电泳分离，分别加入1∶500兔抗鼠CaR抗体、1∶1 000鼠抗人p-AKT单克隆抗体、1∶500兔抗人PI3K多克隆抗体和1∶1 000兔抗鼠CSE单克隆抗体，反复漂洗后加发光剂，感光、显影、定影。

1.3统计学分析采用SPSS13.0软件，组间比较采用ANOVA方法分析。

2　结　果

2.1CaR激动剂联合CaM抑制剂对巨噬细胞中CSE表达的影响与空白对照组(0.803±0.021)比较，GdCl3组(1.741±0.056)明显增强CSE的表达；而U73122组(0.635±0.012)和GdCl3+U73122组(0.607±0.011)CSE 的表达均明显降低。见图1。

2.2CaR激动剂联合CaM抑制剂对巨噬细胞内H2S分泌的影响与空白对照组(13.12±1.04)比较，GdCl3组H2S的相对含量(21.78±1.82)明显增加；U73122组(6.02±0.73)和GdCl3+U73122组(6.57±0.89)H2S的相对含量明显降低(P<0.05)。

2.3CaR激动剂联合CaM抑制剂对巨噬细胞泡沫化程度的影响GdCl3组、U73122组和GdCl3+U73122组作用泡沫细胞48 h后，细胞油红O染色阳性率分别为(17.14±3.30)%、(82.54±1.63)%和(84.15±2.17)%，与空白对照组〔(58.33±2.86)%〕比较，GdCl3组细胞油红O染色阳性率明显降低(P<0.05)；而U73122组、GdCl3+U73122组细胞油红O染色阳性率均明显增加(P<0.05)。

2.4CaR激动剂联合CaM抑制剂对巨噬细胞泡沫化过程中脂质蓄积的影响与空白对照组比较，GdCl3组细胞内CE、FC和TC含量均明显下降，而U73122组、GdCl3+U73122组细胞内CE、FC和TC均明显增加(P<0.05)。见图2。

2.5CaR激动剂联合CaM抑制剂对巨噬细胞PI3K及p-Akt蛋白表达的影响如图3所示，与空白对照组比较，GdCl3组能明显抑制PI3K和p-AKT的表达；而U73122组和GdCl3+U73122组PI3K和p-AKT的表达均被明显增强(P<0.05)。

图1　Western印迹检测单核巨噬细胞中CSE的表达

与空白对照组相比：1)P<0.05；下图同图2　HPLC检测CaR激动剂联合CaM抑制剂对巨噬细胞泡沫化过程中脂质蓄积的影响

图3　Western印迹检测单核巨噬细胞中PI3K和p-AKT蛋白表达情况

3　讨　论

CaM是一种广泛存在于生物体的Ca2+结合蛋白，对细胞功能具有广泛的调节作用。当胞质内Ca2+升高时，Ca2+和CaM结合，形成活性CaM，其构象发生改变，再与靶蛋白或靶酶结合，引起CaM进一步变构及靶蛋白变构，从而产生生物学效应。研究发现〔7〕，当巨噬细胞受到刺激引起胞质Ca2+浓度增加时，CaM可与Ca2+结合，形成有活性的CaM，然后通过活化的Ca2+/CaM通路对CSE 的活性进行调节，从而促进H2S的生成，最终抑制巨噬细胞向泡沫细胞的转化。

CaR在人体分布广泛，主要分布在甲状旁腺、肾脏、胃肠道、骨组织以及其他细胞等。研究已经证实〔8〕，在巨噬细胞内高表达的 CaR可以通过增强CaM 的活性抑制巨噬细胞向泡沫细胞转化。我们前期研究发现，高表达的CaR可以通过增强CSE的表达促进巨噬细胞内H2S的分泌，但该作用的完成是否与CaM的表达变化有关尚不得而知。

本研究发现，增强CaR的表达可以明显增强CSE的表达，但当CaM的表达被抑制时CaR增强 CSE表达的作用被明显降低，说明CaR可能是通过增强CaM的表达提高CSE的活性。本研究通过敏感硫电极法检测发现，高表达的CaR可以明显促进H2S的分泌，但当阻断CaM的表达时CaR促进 H2S分泌的这种作用均被明显抑制。又通过油红O染色和HPLC检测发现，增加CaR的表达可以明显抑制巨噬细胞的泡沫化程度，但当CaM的表达被阻断时CaR抑制巨噬细胞向泡沫化细胞转变的能力被明显降低 。研究已经证实〔9〕，CaM通过增强CSE 的活性促进H2S的生成，进而抑制巨噬细胞向泡沫细胞的转化。而本研究结果发现，CaR可以通过增强CaM的表达提高CSE的活性。因此，我们认为高表达的CaR可以通过增强CaM的表达提高CSE的表达，进而促进H2S的分泌，最终达到抑制巨噬细胞向泡沫细胞转化的作用。

PI3K/AKT信号通路是维持细胞生存、增殖最重要的信号传导通路之一〔10，11〕。PI3K 是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，是许多生命活动中关键的信号分子，可以通过激活或抑制其下游一系列底物调节细胞的增殖、分化、凋亡以及迁移等活动。研究还发现，PI3K/AKT信号通路在巨噬细胞中存在广泛表达，是巨噬细胞调节具有第二信使特征脂类衍生物生成的重要信号通路，是动脉粥样硬化形成的分子基础〔12，13〕。近年来研究已经证实，CaR的激活将影响PI3K/AKT信号通路的活性，而PI3K/AKT信号通路在巨噬细胞的泡沫化过程中起重要作用〔14〕。 本研究结果说明，高表达的CaR可能是通过增强CaM的表达抑制 PI3K/AKT信号通路的活性，进而抑制巨噬细胞向泡沫细胞的转化，阻碍动脉粥样硬化的形成。

1Calvert JW，Coetzee WA，Lefer DJ.Novel insights into hydrogen sulfide-mediated cytoprotection〔J〕.Antioxid Redox Signal，2010;12(10)：1203-17.

2Wilson HM.Macrophages heterogeneity in atherosclerosis-implications for therapy〔J〕.J Cell Mol Med，2010；14(8)：2055-65.

3Rodriguez-Granillo GA，Carrascosa P，Bruining N.Progression of coronary artery calcification at the crossroads：sign of progression or stabilization of coronary atherosclerosis〔J〕?Cardiovasc Diagn Ther，2016；6(3)：250-8.

4Pan Y，Ye S，Yuan D，etal.Hydrogen sulfide(H2S)/cystathionine γ-lyase(CSE) pathway contributes to the proliferation of hepatoma cells〔J〕.Mutat Res，2014；(763-4)：10-8.

5Lee GS，Subramanian N，Kim AI，etal.The calcium-sensing receptor regulates the NLRP3 inflammasome through Ca2+and cAMP〔J〕.Nature，2012；492(7427)：123-7.

6Kamano S，Ikeda S，Sugimoto M，etal.The effects of calcitonin on the development of and Ca2+levels in heat-shocked bovine preimplantation embryos in vitro〔J〕.J Reprod Dev，2014；60(4)：317-23.

7Liang D，Zeng Q，Xu Z，etal.CSE activates Erk 1/2 promoting cell proliferation and survival by Ca2+-CaM KⅡ-dependent inhibition of PP2A in normal and neoplastic B-lymphoid cells〔J〕.Biochem Pharmacol,2014；87(2)：332-43.

8Osipov RM，Robich MP，Feng J，etal.Effect of hydrogen sulfide in myocardial protection in the setting of cardioplegia and cardiopulmonary by-pass〔J〕.Interact Cardiovasc Thorac Surg，2010；10(4)：506-12.

9Ozcan L，Cristina de Souza J，Harari AA，etal.Activation of calcium/calmodulin dependent protein kinase Ⅱ in obesity mediates suppression of hepatic insulin signaling〔J〕.Cell Metab，2013；18(6)：803-15.

10Ahsan A，Han G，Pan J，etal.Phosphocreatine protects endothelial cells from oxidized low-density lipoprotein-induced apoptosis by modulating the PI3K/Akt/eNOS pathway〔J〕.Apoptosis，2015；20(12)：1563-76.

11Huang J，Ledford KJ，Pitkin WB，etal.Targeted deletion of murine CEACAM-1 activates PI3K-Akt signaling and contributes to the expression of(Pro)renin receptor via CREB family and NF-κB transcription factors〔J〕.Hypertension，2013；62(2)：317-23.

12Libby P，Ridker PM，Hansson GK.Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis〔J〕.Nature，2011；473(7347)：317-25.

13Yao W，Li K，Liao K，etal.Macropinocytosis contributes to the macrophage foam cell formation in RAW264.7 cells〔J〕.Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)，2009；41(9)：773-80.

14Wang XZ，Cheng Y，Wu H，etal.The natural secolignan peperomin E induces apoptosis of human gastric carcinoma cells via the mitochondrial and PI3K/Akt signaling pathways in vitro and in vivo〔J〕.Phytomedicine，2016；23(8)：818-27.

〔2016-03-17修回〕

(编辑徐杰)

The regulating of calcium sensing receptor on the expression of CSE of macrophages

LI Chen-Guang, LIU Fei, ZHANG Feng-Xiang.

The First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001, Liaoning, China

ObjectiveTo study the regulation of calcium sensing receptor on the expression of CSE of macrophages.MethodsThe expressions of CSE,PI3K and p-AKT were detected by Western blot.Sensitive sulphur electrode method was used to detect the change of the H2S content in macrophages;the relative content of positive cells was tested by oil red O staining and HPLC was used to measure the intracellular cholesterol content.ResultsThe expression of CSE was significantly enhanced in GdCl3group,while the expressions of PI3K and p-AKT were significantly inhibited in GdCl3group.The expressions of PI3K and p-AKT were significantly enhanced in GdCl3+U73122 and U73122 groups,while the expression of CSE was significantly inhibited in GdCl3+U73122 and U73122 groups.Compared with that of blank control group,the relative content of H2S after acted on foam cells 48h was increased in GdCl3group;while the relative contents of H2S in U73122 and GdCl3+ U73122 groups were significantly reduced.Compared with that of blank control group,the number of positive cells in GdCl3group was significantly decreased,while the number of positive cells were significantly increased in U73122 and GdCl3+ U73122 groups.ConclusionsCaR could depend on enhancing the expression of CSE to increase the secretion of H2S,thereby inhibit the transformation of macrophages into foam cells.

Calcium sensing receptor;Calmodulin；CSE

国家自然科学基金(81541099)

张凤香(1978-)，女，博士，副教授，副主任医师，硕士生导师，主要从事动脉粥样硬化研究。

李晨光(1979-)，男，硕士，住院医师，主要从事脑血管病研究。

〔文献标识码〕A〔文章编号〕1005-9202(2016)16-3871-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.002