梁水美 范阳阳 刘艳艳 卞如如 朱天翼 张全芳 步迅

摘要：为了达到从分子水平上检测化妆品动物源性成分的目的，本研究建立了一种从化妆品中提取动物源性基因组DNA的方法。该方法使用Chelex-100结合玻璃奶提取化妆品中的基因组DNA，具有污染小、操作简单、快速、高效等优点。分别利用紫外分光光度计、普通PCR和DNA测序等方法对提取DNA的质量进行检测，结果表明DNA浓度和纯度均能达到后期分子检测要求。说明本方法提取的DNA适用于在分子水平上检测化妆品的动物源性成分。

关键词：化妆品；动物源性；基因组DNA；提取方法

中图分类号：S188文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）09-0131-05

AbstractIn order to achieve the purpose of detecting animal origin of cosmetics at the molecular level， a method for extracting genomic DNA of animal origin from cosmetics was established. The Chelex-100 and Glass-milk were used to extract genomic DNA from cosmetics. This method had advantages of less pollution， easy to operate， fast and high efficient. Then， the quality of genomic DNA was detected by UV spectrophotometer， PCR and DNA sequencing. The results showed that the concentration and purity of DNA both met the requirements of later molecular experiment. It indicated that the DNA exacted by this method was suitable for the detection of animal origin of cosmetics at the molecular level.

KeywordsCosmetics； Animal origin； Genomic DNA； Extraction method

近年來具有美容护肤功效的马油、马奶和驴奶等被广泛应用于化妆品中，且此类化妆品倍受亚洲女性青睐。马油的应用在我国历史悠久，《名医别录》中记载马脂肪具有生发护发作用，《本草纲目》中记载马脂肪味甘、平、生发。马油易被皮肤吸收且有美白作用，另外还有加速皮肤新陈代谢、增强细胞活力、抗皮肤衰老等功效[1]。马奶被阿拉伯人视为“阿拉所赐的神药”，欧洲贵妇人使用马奶沐浴以保持皮肤光滑、美丽，马奶洗面奶不仅能防止皮肤老化，还有消除皱纹的神奇功效[2]。驴奶中的VA、VE、VC和B族维生素抗氧化、抗衰老，可阻止细胞内不饱和脂肪酸氧化分解，阻止皮肤干燥和角质化，其中所含的芋碱酸可以使皮肤细白、柔嫩光滑、有弹性[3]。

由于马油、马奶和驴奶具有很好的美容功效，所以近年来马油、马奶和驴奶制品的价格均高于普通的牛奶制品，市场需求不断扩大，在经济利益的驱使下，部分没有驴、马资源的化妆品厂家用牛奶冒充驴奶和马奶，甚至有的厂家的马奶、驴奶化妆品中不含有任何动物源性成分，严重危害了消费者的健康和利益。

目前我国对化妆品中动物源性成分的检测还比较薄弱。从分子水平上检测化妆品中的动物源性成分是最准确有效的方法，而该方法首先需从化妆品中提取基因组DNA。由于化妆品特殊的加工工艺及所含成分复杂，其中的DNA成分已受到严重的破坏，这给DNA的提取带来很大困难。本研究旨在建立一种能简单、快速、高效地从化妆品中提取动物源性基因组DNA的方法，为化妆品中动物源性成分的检测奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

市售不同品牌的马和驴动物源性油膏、面膜、面霜、乳液和洗面奶等化妆品共20份。

1.2试剂与设备

Chelex-100为Sigma公司产品；Glass Milk为Thermo产品；DNA分子量Marker DL2000、TaKaRa PCR仪、电泳上样缓冲液等购自宝生物工程（大连）有限公司；蛋白酶K购自生工（上海）有限公司；5424D型高速离心机，Eppendorf公司；凝胶成像仪，BIO-RAD公司。

1.3化妆品中动物源性DNA的提取

取液体状（200 μL）、膏状或固体（200 mg）化妆品样品放入2 mL离心管中，加入5%的Chelex-100 280 μL及20 mg/mL蛋白酶K 20 μL，56℃保温30 min以上，高速振荡5～10 s；100℃水浴8 min，高速振荡5～10 s；13 000 r/min离心3 min，将上清转入新的离心管中（候选步骤，将溶液转移至离心柱中，13 000 r/min离心1 min，收集液体），加入Glass Milk 20 μL及 gDNA Binding Buffer （6 mol/L NaCl） 600 μL，充分混匀，65℃水浴15 min，期间颠倒混匀几次；室温放置5 min，期间颠倒混匀几次；4 000 r/min离心1 min，弃上清，留管底；70%（体积分数）酒精500 μL，洗涤，8 000 r/min离心1 min，重复此步骤2次；加入500 μL无水乙醇，吹打悬浮，洗涤，8 000 r/min离心1 min，弃上清；8 000 r/min离心 30 s，用10 μL枪头吸走残余液体，室温干燥10 min；加100 μL TE （pH 7.0） 70℃水浴5 min，离心，吸取上清转移至新的离心管中，使用Nanodrop核酸检测仪检测DNA的浓度和纯度，要求浓度在1～20 ng/μL之间，OD值1.7～1.8之间，-20℃保存备用。

1.4牛、马和驴通用引物的设计

从NCBI数据库中分别下载牛、马和驴3种动物的线粒体16S rDNA基因序列各10条，并进行同源性比对，选取同源性高的序列两端利用Primer Premier 5.0软件设计一对通用引物，F：5′-AAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTTA-3′，R： 5′-GATTGCGCTGTTATCCCTAGGGTA-3′，扩增片段长239 bp。

1.5常规PCR和DNA测序检测

PCR扩增采用25 μL体系，其中含10×PCR Buffer （含2 mmol/L Mg2+）2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP 2 μL、5 U Taq酶0.2 μL、10 μmol/L正反向引物各1 μL，DNA模板2 μL，超纯水16.3 μL。采用降落PCR程序进行扩增，将PCR产物纯化回收，ABI 3730XL DNA测序仪测序（由山东省农业科学院测序中心完成）。

2结果与分析

2.1基因组DNA质量分析

检测结显示，从20份市售化妆品中提取的基因组DNA OD260/OD280在1.7～1.9之间，平均值为1.8；DNA浓度在14.8～27.8 ng/μL之间，平均浓度为19.8 ng/μL，纯度及浓度均能达到后续PCR检测的要求。

2.2PCR检测结果

以20份市售化妆品中提取的DNA为模板，使用马、牛和驴的通用引物进行PCR扩增，除空白对照无扩增条带外，20份化妆品的DNA均有扩增，片段大小与目的片段一致，且条带清晰。

2.3DNA测序检测结果

20份市售化妆品PCR扩增产物经纯化回收，进行测序验证，结果显示，只有1、7、8、10、11、14、17、18、19的测序峰图单一，无套峰现象，表明这9份化妆品含有的源性成分单一，其他11

份均有套峰现象，表明其中含有不止一种动物源性成分。在NCBI上进行BLAST分析发现，7、10和11为牛源性成分，1、8、14、17、18和19为产品标示的源性成分。部分源性成分单一化妆品的测序峰图见图2-图4。

3讨论与结论

含有动物成分的产品包括化妆品中动物源性成分的检测主要应用近红外法[4，5]、ELISA[6]（酶联免疫吸附反应）和PCR法[7]等。PCR法是目前常用的检测方法，其中实时荧光定量PCR法依据物种特异性DNA序列，是当前物种源性鉴定的金标准。应用分子生物学方法检测化妆品中的动物源性成分，首先需要从化妆品中提取基因组DNA，DNA的质量直接影响PCR扩增和DNA测序等后续试验结果。紫外分光光度计测定可初步明确基因组DNA的浓度和纯度，内源基因的PCR扩增能进一步确定提取DNA的纯度和DNA中是

否存在抑制PCR反应的物质，有效避免PCR反应出现假阳性结果[8]。

以往报道的从化妆品中提取基因组DNA的方法多使用氯仿、异戊醇、甲醇和四氢呋喃等有害试剂[9]，且耗时长，操作繁琐，本研究所使用的Chelex-100和Glass Milk等试剂无毒、提取耗时短、操作简单，具有快速、简单、高效、适用范围广（适用于液状、膏状和固态等不同状态化妆品中DNA的提取）等优点。

应用本方法提取20份市售化妆品基因组DNA，紫外分光光度法检测OD260/OD280值在1.7～1.9范围内，平均纯度为1.8，平均浓度为19.8 ng/μL，表明基因组DNA的质量较好，并通过普通PCR法和DNA测序对提取的DNA进行验证，结果表明本方法能快速有效地提取化妆品中的动物源性DNA。该方法为从分子水平检测化妆品中的动植物源性成分奠定了基础，同时可为相关监督部门对化妆品的监管提供帮助，具有重要的实践性意义。参考文献：

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[6]陸朱发， 邵剑挺. 用双抗夹心ELISA鉴别不同肉类的研究[J]. 动物检疫， 1993， 10（6）： 5-7.

[7]张全芳， 马德源， 刘艳艳，等. 利用多重PCR技术检测羊肉中掺杂狐狸肉的方法研究[J]. 山东农业科学， 2014，46（12）：4-6，10.

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