王代钢 杨金宏 黎欢吉

摘要：应用BmNPV直接PCR诊断技术研究家蚕幼虫后期微量感染BmNPV后蛹体内BmNPV垂直传播侵染模式。结果表明：蛹体内BmNPV侵染模式为感染致死与感染非致死两种受害状态相混模式。感染致死受害状态具有典型病症表现，与幼虫感染模式相同，未构成BmNPV病害垂直传播途径。感染非致死受害状态无典型病症表现，蛹体外观与正常健康蛹体相同，能继续发育羽化成虫产卵，成为BmNPV病害垂直传播的隐疑途径，对蚕种安全构成潜在危害。

关键词：家蚕；血液型脓病；核型多角体病毒（NPV）；蛹体；垂直传播途径

中图分类号：S884.5+1文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）09-0119-05

AbstractThe vertical transmission infection mode of BmNPV in Bombyx mori pupa after micro-infection of BmNPV at late larval stage was researched using direct PCR diagnostic technique. The results showed that the infection mode of BmNPV in pupa was the mixed mode of two damage states of lethal infection and non-lethal infection. The lethal infection damage state showed typical symptoms same as larvae infection mode， which did not form the vertical transmission channel of BmNPV disease. While the non-lethal infection damage state showed no typical symptoms. The pupa had normal appearance same as healthy pupa， which could continue to eclosion and oviposition. This channel was the doubtful vertical transmission channel of BmNPV disease， and it owned potential harm to the security of silkworm eggs.

KeywordsBombyx mori； Nuclear polyhedrosis； Nuclear polyhedral virus； Pupa； Vertical transmission channel

家蚕是具有重要经济价值的鳞翅目昆虫，中国蚕丝业是最具特色的传统产业，蚕茧生丝产量已占世界总产量80%左右。家蚕血液型脓病是制约蚕桑生产的重大病害，占家蚕病害损失量七成以上，其病原是家蚕核型多角体病毒（BmNPV），它能够在家蚕幼虫期和蛹期发生危害，严重时成毁灭性流行危害。家蚕血液型脓病流行危害目前还没有理想的化学药物防治技术，只能实施养蚕环境消毒和淘汰典型病症蚕等技术措施来尽量减少病害损失[1]。

依据家蚕组织病理学方法，只有在幼虫或蛹体的血液里观察到有BmNPV多角体存在时才能确诊为家蚕血液型脓病，目前尚未在家蚕成虫或卵内发现有BmNPV多角体。有研究认为BmNPV只存在环境污染食下侵染的水平传播侵染模式，不存在个体生殖的垂直传播侵染模式[2]，并将BmNPV基因序列分析结果、抗BmNPV遗传规律和控制环境污染食下侵染传播途径作为防控技术研发的依据[3，4]，在BmNPV早期诊断技术和抗BmNPV蚕品种选育上做了大量的防控家蚕血液型脓病实用技术研究[5，6]。针对家蚕血液型脓病是否存在通过个体生殖途径的垂直传播侵染模式，本研究应用了BmNPV直接PCR诊断技术，开展家蚕幼虫后期微量感染BmNPV后蛹体内BmNPV垂直传播侵染模式研究，证实家蚕幼虫后期微量感染对形成BmNPV病害垂直传播途径具有关键作用，为阻断BmNPV垂直传播途径、防控家蚕血液型脓病流行危害提供技术研发理论支持。

1材料与方法

1.1攻毒液制备

取本实验室保存的BmNPV（AK株）多角体稀释液2.5×1010个/mL添食4龄起蚕，复壮增殖BmNPV多角体。于5龄起蚕后收集典型BmNPV病症蚕，剪去病蚕尾角采集血液样品。用CHCl3分解血液样品中的脂肪球等血细胞，无菌水反复差速离心去除杂质，获BmNPV多角体母液置于4℃保存待用。

攻毒试验当日将BmNPV多角体母液放入25～27℃水浴30 min，无菌水离心去除杂质2次，配制成2.5×1010、2.5×109、2.4×108、2.3×107、2.5×106、2.4×105个/mL等多种BmNPV多角体浓度的攻毒液。

1.2幼虫微量攻毒

将家蚕原种871（中系）和872（日系）正常飼养至5龄后期，选体健无病材料蚕幼虫，分别添食6种浓度的BmNPV多角体攻毒液，设添食无菌水对照（清水CK）和无任何添食对照（空白CK）。2个原种共设16个试验处理，每处理100头幼虫，重复3次。为避免在病毒检测时形成试验高峰，2个原种的幼虫微量攻毒试验错时2 d进行。

在幼虫临上蔟前最后一次给桑时，取1 mL攻毒液均匀涂抹于新鲜成熟桑叶表面，室温晾干，切细丝添食，幼虫食下攻毒桑叶后不再给桑，2～4 h后正常上蔟结茧。

1.3蛹体感染调查

上蔟3 d后采削茧取出蚕蛹平摊置23～25℃中，逐日调查各试验处理的蚕蛹死亡数，对死蛹镜检BmNPV多角体并确诊。上蔟15 d后抽取存活蚕蛹样品用直接PCR法检测存活蛹体内BmNPV感染状态。当试验处理存活蛹合并数不足100头时抽取1/2存活蛹进行感染检测；当存活蛹合并数多于100头时抽取50头存活蛹检测；存活蛹合并数多于250头时抽取60头存活蛹检测。未被抽取的存活蛹用于后续成虫感染试验。

1.4直接PCR检测法

BmNPV多角体蛋白基因（polyhedron，polh）为杆状病毒所特有，polh基因序列长为738 bp，编码246个氨基酸，预测分子量为28.85 kD。比较分析发现，polh基因序列与家蚕基因组序列同源性低，有较高的特异性，能够在有家蚕基因组存在的情况下进行polh基因的特异性扩增，可以用家蚕组织样品直接PCR法检测BmNPV。设计引物序列polh f：5′-ATGCCGAATTATTCATACACCCC-3′；polh r：5′-TAATACGCCGGACCAGTGAACAG-3′。

用75%乙醇擦拭蛹体体表，以防体表污染影响试验。从蛹体背部刺取10 μL蛹体血液到1.5 mL离心管中，加入0.5 mL 75%乙醇涡旋1 min，再10 000 r/min离心1 min，倒去上清液，空气中干燥5 min去除乙醇残留，再加入50 μL TE充分溶解。

PCR反应体系为25 μL，含KCl 50 mmol/L，Tris（pH 8.3） 10 mmol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTPs 200 μmol /L（每种），扩增引物0.4 μmol/L（每种），Taq DNA polymerase 1 U，A 0.1 μg/μL，DNA 模版2 μL，ddH2O（pH 7.0）补充至总体积25 μL。该反应体系与常规PCR反应体系相比，其中加入了抗PCR反应抑制物BSA。扩增程序为95℃预变性5 min；94℃变性30 s；55℃退火45 s；72℃延伸55 s，30个循环后72℃终延伸10 min。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳，1%溴化乙锭染色，紫外灯照射观察，Marker为TAKARA的DL2000。

2结果与分析

2.1蛹期BmNPV感染致死结果

在幼虫5龄临上蔟时攻毒微量BmNPV多角体依然可致蛹体感染BmNPV病害致死，感染致死数量与攻毒BmNPV多角体量相关。攻毒量为2.5×1010个/mL时，蛹体15 d死亡率可达87.83%，属重度感染致死状态；攻毒量为2.4×105个/mL时，蛹体15 d死亡率仅为2.17%，与正常饲养条件下自然感染致死状态相当（表1）。

家蚕对BmNPV侵染表现为敏感受害结果，即使在幼虫后期微量感染BmNPV对蛹体的侵害后果同样严重。在不同攻毒浓度间和不同原蚕品系间形成的蛹期受害模式虽有差异，但共同特征明显，与幼虫期受害模式特征截然不同。

2.3.1不同攻毒浓度间的受害模式蛹体在微量感染BmNPV后，不同攻毒浓度处理都能致蛹体死亡，在蛹期6～8 d形成蛹体死亡高峰期，90%～98%蛹体死亡发生在蛹期5～10 d内，蛹体连续死亡集中在蛹期14 d前，到蛹期15 d后各处理均未发生蛹体连续死亡，出现了受害死亡中止现象。这与幼虫期受害模式不同，幼虫受BmNPV侵染后连续死亡现象在攻毒15 d后依然持续发生，直至所有受害幼虫全部死亡为止，没有出现受害死亡中止现象。

2.3.2不同原蚕品系间的受害模式试验用中系原蚕871与日系原蚕872是生产一代杂交种的对交种，在饲养条件基本相同下，中系与日系原蚕的受害模式虽有差异，但共同特征也很明显。

原蚕871在幼虫临上蔟时攻毒BmNPV多角体后，在蛹期6～7 d出现蛹体死亡高峰期。攻毒浓度较高处理的蛹体连续死亡集中在蛹期5～10 d内，到蛹期13 d后出现受害死亡中止现象。攻毒浓度较低或自然感染处理的蛹体连续死亡集中在蛹期5～8 d内，到蛹期10 d后同样出现受害死亡中止现象。

原蚕872的蛹体死亡高峰期出现在蛹期7～8 d时。攻毒浓度较高处理的蛹体连续死亡同样集中在蛹期5～10 d内，直到蛹期15 d后才出现受害死亡中止现象。而攻毒浓度较低或自然感染处理的蛹体连续死亡也集中在蛹期5～8 d内，到蛹期11 d后出现受害死亡中止现象。

不同家蚕原蚕品系蛹体在连续死亡和受害死亡中止现象发生时间上表现略有不同。两者比较，原蚕中系的蛹体连续死亡发生时间较原蚕日系更为集中，受害死亡中止现象也较为提早发生。

3讨论与结论

3.1感染致死与非致死两种受害状态相混的侵染模式

在家蚕幼虫5龄临上蔟时微量感染BmNPV后，蛹体组织器官因变态而发生剧变，改变了BmNPV复制增殖和形成多角体的环境条件，部分蛹体内的病毒多角体数量未达到致死水平，蛹体外观也无BmNPV病害典型症状表现，呈现出感染致死与感染非致死两种受害状态相混的侵染模式。感染致死状态的蛹体在蛹期5～8 d内大量死亡，10～13 d内全部致死，感染非致死状态的蛹体能够继续发育羽化成虫，完成个体生命周期，造成蛹体BmNPV病害痊愈的假象。

家蚕幼虫感染BmNPV后通常表现出感染致死典型病症一种侵染模式，即使在幼虫5龄临上蔟时感染大量BmNPV后，蛹体侵染模式也与幼虫相同。感染非致死无典型病症侵染模式只有用PCR检验法才能被发现。如果仅以感染致死典型病症作为蛹体BmNPV病害确诊标准，就会忽视感染非致死无典型病症侵染模式，致使BmNPV在家蚕蛹体内存留潜伏，进而放任感染非致死无典型病症，蛹体进入到羽化成虫产卵环节，可使一代杂交普通种成为BmNPV病害初传染源。

3.2微量感染模式是BmNPV病害垂直传播的关键因素

在家蚕幼虫5龄临上蔟时微量感染BmNPV不能致所有受害蛹体死亡，感染非致死无典型病症的蛹体外观上与正常健康蛹体相同，还能继续发育羽化成虫产卵，但其蛹体内BmNPV感染率在54.17%以上，构成了BmNPV病害垂直传播的隐疑途径。所以，微量感染模式所产生的感染非致死无典型病症蛹体是构成BmNPV病害垂直传播途径的关键因素。

家蚕幼虫微量感染BmNPV的几率很小，感染致死典型病症侵染模式就成为了确诊BmNPV病害发生的标准。由微量感染模式引起的蛹体受害死亡中止现象和感染非致死无典型病症现象很容易被误认为是BmNPV病害痊愈的结果，误将15 d存活蛹认作健康蛹体而通过调查评鉴环节。在抗BmNPV蚕品种选育中感染非致死无典型病症侵染模式，将会混淆基因抗性灭活作用和个体耐受作用，可致抗BmNPV蚕品种始终携带BmNPV，危害蚕品种安全；如果在种茧育中不加以识别和及时淘汰感染非致死无典型病症蛹体，会将含有BmNPV的一代杂交普通种发放到农村，对农村小蚕共育和丝蚕茧育安全产生严重危害。参考文献：

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