汤春波，周永，陈伟，高文波，吴齐全，周酉枫，齐勇

表没食子儿茶素没食子酸酯对大鼠肾草酸钙结石模型成石的影响

汤春波，周永，陈伟，高文波，吴齐全，周酉枫，齐勇

目的观察不同剂量表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对大鼠肾结石模型成石的影响。方法50只雄性SD大鼠分为5组，A组为空白对照组；B组为单纯成石组，采用1%乙二醇及2%氯化铵进行配制成的造石液2ml灌胃；C、D及E组均为EGCG干预组，分别在B组处理方法的基础上每天予10、30及50 mg/kg的0.1%EGCG溶液灌胃处理；均连续进行28 d。取右肾组织测定丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）水平；左肾冰冻切片，偏光显微镜观察结晶情况。结果B组较A组肾组织MDA浓度显著增高，而SOD、GSH-Px、CAT浓度显著降低（均＜0.01）。与B组比较，C、D及E组肾组织MDA水平降低及SOD水平增加（均＜0.01）。肾组织结晶与EGCG治疗剂量呈负相关（=―0.483，＜0.01）。结论过氧化损伤是导致高草酸诱导的肾小管上皮细胞损伤的主要机制和结石形成的主要途径；EGCG可减轻机体的过氧化损伤，降低形成肾结石的危险性。

泌尿系统结石；表没食子儿茶素没食子酸酯；大鼠

泌尿系统结石是常见病，且治疗后复发率居高不下。据报道，男性泌尿系统结石复发率为70%～80%，女性为47%～60%，其复发率高的原因主要是未对结石病因进行有效的治疗。在泌尿系结石中，草酸钙是最常见的类型，多项研究表明其与自由基过度产生及氧化应激损伤是导致草酸钙结石发生的重要原因［1］，而表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）具有较强的抗氧化生物学活性。本研究以乙二醇联合氯化铵制作大鼠草酸钙肾结石模型，并用不同剂量EGCG进行干预，观察肾组织中的结晶沉积情况，同时检测肾组织内丙二醛（MDA）、抗氧化酶浓度，以更进一步探讨草酸钙肾结石形成机制及寻求抑制其形成的方法。报道如下。

1　资料与方法

1.1动物及分组雄性SD大鼠50只，体质量190～210 g，由浙江大学动物实验中心提供。进行1周的适应性饲养后随机分为5组。A组为空白对照组，继续使用标准常规饲料及纯净水饲养；B组为单纯成石组，采用1%乙二醇及2%氯化铵进行配制成的造石液2 ml灌胃；C组为低剂量EGCG干预组，在B组处理方法的基础上每天予 10 mg/kg的0.1%EGCG溶液灌胃处理；D组为中剂量EGCG干预组，在B组处理方法的基础上每天予30 mg/kg的0.1%EGCG溶液灌胃处理；E组为高剂量EGCG干预组，在B组处理方法的基础上每天予50 mg/kg的0.1%EGCG溶液灌胃处理；均连续进行28 d。

1.2检测指标与方法采用过量 10%水合氯醛腹腔注射处死大鼠，将大鼠处死后剖开腹腔暴露肾脏，小心钳夹并取出双侧肾脏，左侧肾脏以10%中性甲醛溶液固定，经过脱水、透明以及石蜡包埋等过程后，制成厚度为4 m的肾脏组织切片进行HE染色，在光学显微镜下对肾脏组织进行观察。主要观察对象为游离结石、结晶沉淀物以及钙化斑等病理改变，可根据以下标准对草酸钙结石严重程度进行观察：肾皮质、髓质及肾乳头形态结构正常，未见显著的结晶沉淀物及肾结石计0分；肾脏皮质及髓质内可见散在的、少量的结晶沉淀计1分；肾盂、肾皮质以及髓质内可见明显的游离结晶以及结晶沉淀物计2分；可见肾盂扩张积水、肾乳头部位可见钙化斑、肾皮质及髓质内可见较多结晶计3分；肾盂明显扩张积水、肾乳头部位可见钙化斑、肾皮质及髓质内可见大量结晶并伴有游离结石形成计4分。总分为各结晶等级×相对应的结晶结果数目之和。

取右侧肾脏以玻璃匀浆器经精细研磨后，制备组织制成匀浆。用硫代巴比妥酸（TBA）法测定丙二醛（MDA）含量：MDA可与TBA化合呈粉红显色反应，测其吸光度A值，以四乙氧基丙烷作为标准品，可推算出MDA含量；用黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶（SOD）活性：黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶作用下可生成O2－，SOD可催化O2－与H+反应生成H2O2，通过测定管与对照管比较吸光度，计算出样品中SOD活性；采用紫外分光光度法测定过氧化氢酶（CAT）活性：CAT在一定条件下可直接分解其底H2O2，相应的吸光度降低，以每克血红蛋白中或每毫克组织蛋白中CAT每秒分解过氧化氢的相对量为一个活力单位，计算 CAT活力；采用 2-硝基苯甲酸（DTNB）比色法测定谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Px）活性：GSH-Px活力用催化GSH氧化的反应速度表示。GSH和DTNB反应在GSH-Px催化下可生成5-二硫代2-硝基苯甲酸阴离子，测定其浓度，即可算出GSH减少量。

1.3统计方法数据采用SPSS 13.0统计软件分析，计量资料均采用均数±标准差表示，多组间比较采用检验，多重比较采用检验；相关性分析采用Spearman等级相关分析。＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1MDA含量及SOD、CAT、GSH-Px活性比较B组较A组肾组织MDA浓度显著增高，而SOD、GSH-Px、CAT浓度显著降低（均＜0.01）。与B组比较，C、D及E组肾组织MDA水平降低及SOD水平增加（均＜0.01）。见表1。

2.2草酸钙结晶沉积情况大体标本上看，B组大鼠肾脏与A组相比肿胀明显，剖面皮质及髓质之间分界不清，触之有明显的砂粒感；而经EGCG治疗后肾脏大体形态与对照组差别不明显。通过对肾组织切片HE染色观察，发现结石组大鼠肾盂明显扩张，肾脏皮质及髓质内可见结晶及结石形成，而经EGCG治疗后上述病理变化明显减轻。肾组织结晶与EGCG治疗剂量呈负相关（=―0.483，＜0.01）。见表2。

表1　5组MDA含量及SOD、CAT、GSH-Px活性比较

表2　各组大鼠肾组织草酸钙结晶等级评分

3　讨论

肾结石可引起梗阻的导致肾积水以及继发尿路感染，严重者可导致肾功能衰竭及尿源性脓毒血症的发生，而肾结石成分最主要类型是草酸钙结石。因此探求肾脏草酸钙结石的形成的具体机制从而寻求抑制其生成或复发的方法具有重要意义。草酸钙肾结石的病因复杂，到目前为止对其了解的程度仍十分有限，在控制草酸钙肾结石的罹患率和复发率方面，仍未达到令人满意的效果。

乙二醇法是近年较常用的制造草酸钙肾结石大鼠模型方法，以作为草酸的前体物质，乙二醇在进入体内后，可在羟乙酸氧化酶的作用下生成乙醛酸，后者可进一步转化为草酸，此时动物尿中草酸浓度增加。正常情况下肾小管尿液中新生的草酸钙结晶很快被尿流冲走，无法停留聚集形成结石。在结石形成过程中草酸钙结晶滞留在肾小管内是必要的前提条件［2］。高浓度尿草酸能使肾小管上皮产生大量的自由基，而组织中的抗氧化酶水平和活性显著降低。为这种氧自由基增加引起的脂质过氧化，是细胞损伤的直接原因［3］。由于氧自由基与生物膜系统的不饱和脂肪酸具有高度亲和性，两者结合后使膜的不饱和脂肪酸与蛋白质比例失调，膜的液态性、流动性及通透性均随之发生变化，最终造成膜的功能障碍。肾小管上皮细胞膜受损，使草酸钙结晶能黏附于肾小管内壁，进而形成结石［4］。Grases等［5］在体外通过模拟肾脏的条件，证明自由基可引起上皮细胞损伤，产生一个有利于晶体生长的环境，而抗氧化剂可抑制草酸钙晶体的形成。可见过氧化损伤是导致高草酸诱导的肾小管上皮细胞损伤的主要机制和结石形成的主要途径［6］。本研究草酸钙肾结石大鼠模型肾脏组织学检查发现大鼠肾皮质及髓质内均有大量草酸钙结晶形成，同时发现肾组织中丙二醛浓度升高，而抗氧化酶活性降低，说明该肾结石大鼠模型在草酸钙结石形成过程中氧化应激扮演了重要的角色。

茶多酚是绿茶提取物中多酚类物质的总称，具有多种较强的抗氧化生物学活性成分，如黄酮类、儿茶素、酚酸类以及花色苷类等［7］。儿茶素是黄烷醇的衍生物之一，可分为四类，茶多酚以EGCG含量最高［8］。EGCG分子量为458.4，结构式为C22H18O11，其分子结构中的三羟基结构B环与其抗氧化能力有关。绿茶多酚其活性成分主要包括表EGCG可通过其抗氧化能力对肾组织损伤起保护作用。使用EGCG处理输尿管闭塞动物，肾组织中活性氧水平显著下降，组织损伤明显减轻，同时能够明显延缓肾功能下降的发生。在狼疮肾炎动物中使用EGCG，其肾功能、尿蛋白以及肾组织病理损伤较肾炎小鼠显著改善［9］。以上文献回顾结合氧化应激在泌尿系草酸钙结石的发生发展过程中的重要作用，推测具有抗氧化及保护肾脏作用的EGCG很可能对对草酸钙肾结石形成具有抑制作用。

本实验用不同剂量EGCG干预草酸钙肾结石动物大鼠模型成石，结果大鼠肾组织中的MDA显著低于成石组，而抗氧化酶浓度均显著高于成石组。肾组织中的结晶沉积情况亦随EGCG剂量增加逐渐减少，两者呈负相关。此结果进一步说明氧化应激在泌尿系草酸钙结石的发生发展过程中的重要作用，而EGCG可以明显减少诱石剂诱导的大鼠肾草酸钙结石的形成。

［1］辛文虎，明星.肾小管上皮细胞损伤与草酸钙肾结石形成机制的研究进展［J］.国际泌尿系统杂志，2013，33（4）:539-542.

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［3］Selvam R.Calcium oxalat e stone disease: roleoflipidperoxidationandantioxidants［J］. Urol Res，2002，30:35.

［4］Itoh Y，Yasui T，Okada A，et al.Examination of the anti-oxidative effect inrenal tubular cells and apoptosis by oxidative stree［J］.Urol Res，2005，33（4）:261-266.

［5］Grases F，Garcia-Ferragut L，Costa-BauzaA.Developmentofcalciumoxalate crystals on urothelium effect of free radicals［J］.Nephron，1998，78（3）:296-301.

［6］厉建，李文峰，张士青.尿草酸对肾草钙结石形成和肾组织自由基影响的研究［J］.中国实验诊断学，2008，12（7）:853-855.

［7］孙海岚.茶多酚的抗炎研究进展［J］.重庆医学，2012，41（35）:3766-3768.

［8］葛建，林芳，李明揆，等.表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）生物活性研究进展［J］.安徽农业大学学报，2011，38（2）:156-163.

［9］张媛媛，侯卫平，袁发焕，等.EGCG对肾脏疾病保护作用的研究进展［J］.中国中西医结合肾病杂志，2013，14（11）:1022-1024.

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.04.045

R692.5

A

1671-0800（2016）04-0502-03

2015-11-10

（本文编辑：钟美春）

宁波市自然科学基金项目（2013A610267）

315100宁波，宁波市泌尿肾病医院

汤春波，Email：TCB73@ 163.com