陶鹏宇，施明杰，黄永焯，王慧媛，徐勤

（1.中国科学院上海药物研究所，上海　201203；2.广州中医药大学热带医学研究所，广东广州　510405）

双氢青蒿素逆转人结肠癌耐药细胞耐药性的研究

陶鹏宇1，2，施明杰1，黄永焯1，王慧媛1，徐勤2

（1.中国科学院上海药物研究所，上海201203；2.广州中医药大学热带医学研究所，广东广州510405）

【目的】评价双氢青蒿素逆转人结肠癌细胞HCT8/ADR耐药性的能力，研究其逆转耐药的机制。【方法】采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法、流式细胞术分别进行细胞毒性、细胞凋亡实验评价双氢青蒿素和阿霉素联合用药的药效，采用Western blot法研究逆转耐药的机制。【结果】双氢青蒿素和阿霉素联用后对人结肠癌耐药细胞有较高的毒性，能诱导耐药细胞凋亡，增强耐药细胞的自噬。【结论】双氢青蒿素能逆转耐药性，恢复耐药细胞对化疗药物的敏感性。

双氢青蒿素；结肠癌/中西医结合疗法；耐药；自噬；细胞培养；细胞凋亡

结肠癌是常见的恶性肿瘤，化疗药物治疗是最常用的治疗手段之一，然而其疗效常常受多药耐药性（multidrug resistance，MDR）的限制［1］。肿瘤多药耐药的发生涉及多种机制，包括ATP结合盒（ATP-binding cassette，ABC）转运蛋白的高表达［2］，对药物诱导的DNA损伤修复能力的增强［3］，细胞自噬的诱导［4］，细胞凋亡途径的抑制及抗凋亡机制的增强［5］等。

青蒿为菊科植物黄蒿Artemisia annua L.的干燥地上部分，其抗疟作用的主要有效成分为青蒿素。双氢青蒿素（DHA）是青蒿素衍生物，具有水溶性强、易吸收、代谢排泄迅速、毒副作用弱等优势［6］。双氢青蒿素在治疗耐氯喹或对其他多种药物耐药的脑型疟和恶性疟时有特效［7］，在治疗血吸虫、抗炎、免疫调节、抑制瘢痕增生等方面也表现出明显的调节功能［8］。近年来，双氢青蒿素的抗肿瘤活性亦引起了人们的关注。

本研究以人结肠癌耐药细胞HCT8/ADR为研究对象，考察双氢青蒿素与阿霉素（DOX）联合应用对该细胞的增殖抑制、诱导凋亡的作用，并采用Western blot法对双氢青蒿素逆转耐药的作用机制进行了初步的研究，从而为中药联合化疗药物治疗肿瘤提供新的思路，现报道如下。

1　材料与方法

1.1药物、试剂与仪器双氢青蒿素（DHA，批号：MB 6911）和阿霉素（DOX，批号：MB 1087）均购于大连美仑生物技术有限公司。β-巯基乙醇、过硫酸铵、异丙醇、甘氨酸、十二烷基硫酸钠（SDS）、溴酚蓝、甲醇、二甲基亚砜、碘化丙啶（PI）等均购于国药集团化学试剂有限公司；RMPI-1640细胞培养基干粉、胎牛血清购于美国Gibco公司；异硫氰酸荧光素（FITC）标记的重组人磷脂结合蛋白Annexin V（Annexin V-FITC）细胞凋亡检测试剂盒、2，2-联喹啉-4，4-二甲酸二钠（BCA）蛋白浓度测定试剂盒购于碧云天生物技术公司；抗微管相关轻链蛋白LC3抗体、抗细胞周期相关蛋白Cyclin D1抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（H+L）抗体均购于美国Abcam公司。微孔滤膜（美国Millipore公司）；LDZX-50KBS高温高压灭菌锅（上海申安医疗器械）；X85-2磁力加热搅拌器（上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司）；EPS300电泳仪（上海天能科技有限公司）；GelDoc XR凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；Mini-protein电泳仪（美国Bio-Rad公司）；1510全波长酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；LA850酸度计（德国SCHOTT集团）；TS-1000脱色摇床（海门市其林贝尔仪器公司）；R8-1涡旋混合器（中国北京吴诺斯科技有限公司）；HF90细胞培养箱（中国Heal Force生物医疗科技控股有限公司）；培养基抽滤器（美国Nalgene公司）；Beckaman MICR OLUGE16小型台式离心机（美国Beckman Coulter有限公司）；XDS-1R倒置显微镜（意大利Optika公司）；细胞计数板（上海医疗设备厂）；Ultra pure plus 12-A纯水仪（上海和泰仪器公司）。

1.2细胞株及细胞培养人结肠癌耐药细胞株HCT8/ADR及母本细胞株HCT8由中科院上海药物所丁健研究员赠予。用含体积分数10%胎牛血清的RPIM-1640培养基，在体积分数5%CO2、37°C的培养箱中连续培养。

1.3双氢青蒿素和阿霉素联用对肿瘤细胞的增殖抑制采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定双氢青蒿素和阿霉素联用的抗肿瘤增殖能力。消化、收集对数生长期的HCT8/ADR细胞，以5×103/孔的密度接种于96孔板，继续培养24 h。实验组为阿霉素组、双氢青蒿素组、阿霉素和双氢青蒿素联用组，共计3组，另设空白对照组。按照实验设计方案加入相应浓度的药物，浓度如下：阿霉素组为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mg/L；双氢青蒿素组为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mg/L；阿霉素和双氢青蒿素联用组分别固定双氢青蒿素浓度为5 mg/L和10 mg/L，阿霉素浓度依次为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5 mg/L；每个浓度设置6个复孔。48 h后，向每孔加入20 μL MTT溶液，培养箱中孵育4 h，吸去培养液，每孔加入200 μL DMSO。震荡1 min，在490 nm下测定吸光度（D）值，按以下公式计算细胞存活率：p细胞存活（%）= D实验组/D对照组×100%。

1.4双氢青蒿素和阿霉素联用诱导肿瘤细胞凋亡

采用Annexin V/PI双染法测定细胞凋亡率。取对数生长期的HCT8/ADR细胞种于12孔板中，细胞密度为5×104/孔，继续培养24 h后进行实验。实验分为阿霉素、双氢青蒿素、阿霉素和双氢青蒿素联用3组，另设立空白对照组。按照实验设计方案加入相应浓度的药物，浓度如下：阿霉素组分别为0.05、0.1 mg/L；双氢青蒿素组10 mg/L；阿霉素和双氢青蒿素联用组固定双氢青蒿素浓度为10 mg/L，阿霉素浓度分别为0.05、0.1 mg/L。每个浓度设置3个复孔。弃去培养基，加入含不同样品的含体积分数10%血清的细胞培养基，每孔0.5 mL，继续培养24 h。胰酶消化，离心收集细胞，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，分别加入Annexin V-FITC 和PI染色液，在30 min内进行流式细胞仪检测。Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

1.5微管相关蛋白轻链3（LC3-II）和细胞周期蛋白（Cyclin D1）的检测采用Western blot方法，检测相关蛋白在HCT8/ADR上的表达情况。各组药物浓度分别为双氢青蒿素10 mg/L，阿霉素0.1 mg/L，双氢青蒿素10 mg/L+阿霉素0.1 mg/L。每个浓度设置3个复孔。给药48 h后，胰酶消化，离心收集细胞，置于冰上，加入预冷的细胞裂解液裂解破碎细胞，4°C裂解30 min。4°C、12 000 r/min离心10 min，吸取上清，采用BCA定量试剂盒测定蛋白浓度。在样品中加入缓冲液，煮沸5 min使蛋白质变性，采用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）分离，转膜后进行非特异性封闭，加入LC3、Cyclin D1抗体4°C孵育过夜，然后用含有体积分数0.1%吐温20的三（羟甲基）氨基甲烷—盐酸（Tris-HCl）缓冲盐溶液洗3次，加入二抗孵育1 h。显色，洗膜后，成像检测。采用Image J2软件进行图片灰度分析，对蛋白表达进行半定量分析。

1.6统计方法采用Origin 9.0统计软件处理数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验（Student's t test）分析组间差异。

2　结果

2.1双氢青蒿素和阿霉素联用对肿瘤细胞的增殖抑制结果在HCT8/ADR细胞中，单独使用阿霉素或者双氢青蒿素时，即使在高浓度（10 mg/L），细胞存活率仍维持在80%以上（图1）；而当双氢青蒿素以5 mg/L的浓度与阿霉素联合使用时，实验组在阿霉素浓度为 1.5 mg/L时就可以将细胞存活率降到50%。如果进一步将双氢青蒿素的给药量增至10 mg/L，细胞存活率在阿霉素浓度为0.05 mg/L时即可降至50%以下（图2）。高浓度（10 mg/ L）与低浓度（5 mg/L）双氢青蒿素处理组的细胞存活率比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。表明双氢青蒿素可以增强化疗药物对耐药细胞的毒性。

图1　不同浓度双氢青蒿素和阿霉素对HCT8/ADR的细胞毒性实验结果Figure 1　Cytotoxicity test of HCT8/ADR treated with the same concentration of DOX or DHA　（±s，N=6）

2.2细胞凋亡结果正常的活细胞（Q4区，左下）不能被Annexin V-FITC和PI染色，凋亡晚期细胞（Q2区，右上）可以同时被Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）染色，而凋亡早期细胞（Q3区，右下）仅能被Annexin V-FITC染色。图3结果显示：在相同阿霉素浓度（0.05 mg/L）下，联合用药组发生早期和晚期凋亡的细胞比例为25.54%，游离阿霉素组仅为4.15%，联合用药组与DOX组、DHA组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。如果进一步增加阿霉素浓度（0.1 mg/L），则联合用药组的凋亡细胞比例上升至42%，游离阿霉素组仅为6.29%。图4结果表明：联合用药组的细胞凋亡比例与单药组比较，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），表明联合用药组能显著引起耐药细胞HCT8/ADR的细胞凋亡。

图2　联合用药对HCT8/ADR的细胞毒性实验结果Figure 2　Cytotoxicity test of HCT8/ADR treated with DOX combined with 5 or 10 mg/L DHA　（±s，N=6）

2.3各组自噬相关蛋白的表达图5、图6结果显示：48 h后阿霉素组HCT8/ADR细胞的LC3-Ⅱ表达量与空白对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；双氢青蒿素组和联合给药组LC3-Ⅱ表达量均上调，但联合给药组LC3-Ⅱ的表达显著增高（P ＜0.01），自噬活性最高。双氢青蒿素组和联合给药组可显著抑制Cyclin D1表达，与空白对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01），这也从另一方面证实了双氢青蒿素可以促进耐药细胞的自噬。

3　讨论

近年来，通过大量研究证实，联合用药可以在抗肿瘤治疗中发挥重要作用，其通过把不同杀伤作用机制的抗肿瘤药物（或治疗方法）联合起来通过协同作用把较微弱的死亡信号放大，降低肿瘤细胞对细胞毒药物的耐药性，增强抗肿瘤药物对肿瘤的杀伤作用，确保发生有效的细胞凋亡［9］。因此，抗肿瘤药物联合作用可以作为一种克服单一药物治疗阻碍的有效治疗策略。而且，低浓度药物的联合作用对于临床治疗更具有可行性，可以减轻毒副作用、改善患者体质、延长寿命和改善生活质量［10］。克服肿瘤耐药性的治疗策略已从最初的单一用药向联合用药方向转变，从机制的互补、作用的协同、不良反应的减轻等方面发挥作用。

图3　各组HCT8/ADR细胞凋亡流式细胞图Figure 3　The cell apoptosis test in HCT8/ADR

图4　各组处理后凋亡细胞比例比较Figure 4　The apoptotic rate of each group after treatment with DOX，DHA and their combination　（±s，N=3）

图5　各组LC3和Cyclin D1表达凝胶电泳图Figure 5　LC3 and Cyclin D1 protein expression in HCT8/ ADR cells detected by gel electrophoresis

图6　各组LC3和Cyclin D1的表达半定量分析结果比较Figure 6　Semi-quantitative analysis of LC3-Ⅱand Cyclin D1 protein expression in HCT8/ADR cells after treatment　（±s，N=3）

LC3是参与自噬泡形成的重要蛋白，分为I型和II型。细胞中新合成的LC3经过加工，成为胞浆可溶性LC3-I。LC3-I经泛素化加工修饰，与自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺（PE）结合，转变为LC3-II，这一进程是自噬过程中必不可少的阶段。因此，LC3-II是自噬发生的特异性标记蛋白，LC3-II的含量及LC3-II与LC3-I的比例可标志自噬体的数量和自噬发生的程度［11］。

真核细胞的分裂周期遵循G1-S-G2-M演变规律，细胞周期蛋白Cyclin D1在细胞G1/S转换过程中发挥关键作用，决定细胞是否进入分裂周期和继续增殖，是细胞周期进程的调节分子。目前已在一些人类癌症细胞中发现Cyclin D1的过度表达［12］。Cyclin D1能够通过泛素化降解［13］；细胞内另一个重要的降解机制是自噬，自噬也同样会引起Cyclin D1的降解［14］。因而，将自噬作为治疗靶点是克服肿瘤细胞多药耐药的一个重要策略。

近年来，对自噬在肿瘤细胞耐药机制中的作用研究有着2种截然不同的观点。一部分研究发现激活自噬能够引起化疗耐受，作为一种保护机制对肿瘤细胞起到保护作用［15-17］。但另有文献报道自噬有助于化疗增敏，例如，Lee等［18］报道组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA通过诱导自噬相关的细胞死亡而杀伤耐药乳腺癌细胞；Yang等［19］则发现一种ATP竞争性的PI3K/mTOR抑制剂类新药NVP-BEZ235通过直接激活自噬和阻滞细胞周期杀伤对顺铂耐药的尿路上皮癌细胞；伊马替尼可通过增强自噬逆转卡波济氏肉瘤对阿霉素的耐药性［20］。因此，将自噬作为治疗靶点是克服肿瘤细胞多药耐药的一个重要策略。

国内外研究发现，双氢青蒿素能通过促进细胞凋亡对多种肿瘤细胞产生杀伤作用［21-23］；青蒿素的衍生物也能够增强肿瘤细胞对放疗的敏感性［24-25］。本研究结果显示：联合双氢青蒿素和阿霉素处理耐药细胞促进了细胞凋亡；检测各处理组细胞的自噬水平后发现，联合给药组LC3-II的蛋白表达量显著增高，而Cyclin D1的表达量显著降低。通过细胞毒性和凋亡实验证明了双氢青蒿素可以通过增强自噬的方式恢复人结肠癌耐药细胞HCT8/ADR对阿霉素的敏感性，具有逆转耐药的作用。这为临床治疗多药耐药肿瘤提供了一个新的研究方向。

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【责任编辑：黄玲】

Reversal of Multidrug Resistance of Human Colon Cancer Cells by Dihydroartemisin

TAO Pengyu1，2，SHI Mingjie1，HUANG Yongzhuo1，WANG Huiyuan1，XU Qin2
（1.Shanghai Medicine Institute of Chinese Academy of Sciences，Shanghai 201203，China；2.Tropical Medicine Institute，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405 Guangdong，China）

Objective To investigate the multidrug-resistance reversal action and mechanism of dihydroartemisin （DHA）on human colon cancer cell line HCT8/ADR.Methods The cytotoxicity of dihydroartemisin combined with doxorubicin（DOX）was determined by methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay and cell apoptosis was observed by flow cytometry.Western blot assay was used to measure the autophagy.Results The combined treatment with dihydroartemisin and doxorubicin significantly enhanced the cytotoxicity in HCT8/ADR cells and effectively increased the apoptotic level.Autophagy was also induced by the combined treatment，which maybe played a crucial role in the regulation of doxorubicin-sensitization of HCT8/ADR cells.Conclusion The results indicated that dihydroartemisin can reverse multidrug resistance through increasing the doxorubicin-sensitivity of HCT8/ADR cells.

dihydroartemisin；colonic cancer/TCM-WM therapy；multidrug resistance；autophagy；cell culture；apoptosis

R285.5

A

1007-3213（2016）05-0698-06

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.05.019

2016-05-01

陶鹏宇（1989-），男，硕士研究生；E-mail:1120821481@qq.com

王慧媛（1985-），女，副研究员；E-mail:wanghuiyuan@simm.ac.cn；徐勤（1963-），男，教授；E-mail:xuqin@163.com

国家自然科学基金资助项目（编号:81402883）；中国科学院设备研制项目（编号:YZ201437）；广东省科技计划项目（编号: 2015A040404042）