陈　琳， 李秉钧， 冯俊荣

( 烟台大学海洋学院，山东 烟台 264005)



利用大西洋鲑内源酶酶解加工废弃物制取抗氧化肽的研究

陈琳， 李秉钧， 冯俊荣

( 烟台大学海洋学院，山东 烟台 264005)

大西洋鲑(Salmosalar)加工废弃物中含有丰富的蛋白质，具有较高的开发利用价值，直接遗弃会造成资源浪费和环境污染，探索利用自身内源蛋白酶酶解制取抗氧化肽具有重要的意义。对大西洋鲑内脏所含内源蛋白酶的性质进行了初步研究，测得主要含有3种内源蛋白酶，最适pH为2.0、6.0、9.0，pH 9.0的碱性蛋白酶具有最高的酶比活力。以水解度和总抗氧化活性为指标，通过单因素试验确定大西洋鲑内源蛋白酶处理鲑鱼的加工废弃物干粉料的最适条件，再用正交实验L16(45)对其酶解条件进行优化，确定影响酶解液总抗氧化活性的主要影响因素(P﹤0.05)为温度、pH和酶解时间，比较后得到最佳酶解条件为：温度35℃、加酶量0.7 mL/50 mL、料液比0.7 g/50 mL、pH 9.0、酶解时间7 h，该条件下酶解液的总抗氧化活性为258.29 U，大西洋鲑加工废弃物干粉料水解度为15.00%。研究表明，采用大西洋鲑内源蛋白酶酶解鲑鱼加工下脚料并制取抗氧化肽，具有一定的可行性。

大西洋鲑鱼；内源蛋白酶；酶解；抗氧化肽；正交

在大西洋鲑(Salmosalar)加工过程中会产生了大量的废弃物，其中含有大量的蛋白质，直接遗弃不但造成资源浪费还污染环境[1-2]，与此同时，世界性的蛋白质资源匮乏日益严重。因此，如何有效利用大西洋鲑鱼加工废弃物是一个亟待解决的问题[3]。抗氧化肽是指具有抗氧化生理活性的多肽类，近年来已成为食品科学领域的研究热点之一[4-5]。酶解法是一种获得抗氧化肽的有效方式[6]，主要有内源酶酶解法、外源酶酶解法和微生物酵解法。内源酶酶解法是一种广泛使用的可提高鱼蛋白溶解度并改善其功能性的方法[7-8]。目前，利用大西洋鲑鱼内源酶来酶解鲑鱼加工废弃物，以制取抗氧化肽的研究较少。

本文初步研究了内源蛋白酶的性质，并以大西洋鲑加工废弃物为原料制成干粉[9-10]，探索其酶解的单因素最适条件，并用正交法进行优化，以确定内源酶酶解制备抗氧化肽的最佳条件。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

材料与试剂：大西洋鲑加工废弃物(鱼头、鱼鳍和鱼尾)；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、盐酸、氢氧化钠、甲醛等均为分析纯；总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

仪器：HYQ150生物摇床(武汉汇诚生物科技有限公司)，H1650-W型台式高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，V-1100D型可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)，LDZM-40KCS型立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)。

1.2实验方法

1.2.1大西洋鲑鱼主要成分测定和原料处理

蛋白质含量测定采用微量凯氏定氮法[11]，脂肪含量测定采用索氏抽提法[12]，灰分含量测定采用灼烧法[13]。原料处理：原料切碎→烘干(70℃，24 h)→绞碎→第一次脱脂(乙醇原料比4∶1)→烘干(70℃，2 h)→第二次脱脂(异丙醇原料比2∶1)→烘干(70℃，24 h)→过筛网(120目)。

1.2.2内源蛋白酶、酶解液制备

将大西洋鲑鱼内脏切成小块冷冻备用。粗酶的提取方法参照Fu等[14]的方法。称取混合内脏360 g以1∶1(m/m)的比例加入50 m mol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH 7.0)，高速匀浆，并在4℃、10 000 r/min条件下离心20 min，上清液即为所需粗酶液。

酶解步骤：一定料液比的脱脂鱼粉加入相应pH的缓冲液后高压蒸汽灭菌，无菌操作加入粗酶液，在35℃～60℃下培养1h～7h→沸水浴灭酶(10 min)→离心(10 000 r/min，20 min)→酶解液。

1.2.3酶解液生化指标测定

α-氨基氮含量测定采用甲醛滴定法[13]，总抗氧化活性测定采用总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂盒。总抗氧化能力计算公式：

MT-AOC=(A-A0)×(V1/V2)×

N×V3×100/30

式中：MT-AOC—总抗氧化能力，U；A—测定OD值；A0—对照OD值；V1—反应液总量，mL；V2—取样量，mL；N—样本测试前稀释倍数；V3—发酵液体积，mL。

1.2.4蛋白酶比活力测定

蛋白酶比活力测定采用福林-酚法，以酪蛋白为底物，酶活力单位定义为每分钟分解底物产生1 μg酪氨酸的酶量[15-16]。用酪蛋白水解法来测定不同pH条件下粗酶分解蛋白质的活性[15]。不同pH的选择缓冲液为：pH 1.0～2.0，0.1 mol/L 氯化钾-盐酸；pH 3.0～6.0，0.1 mol/L 柠檬酸钠-柠檬酸；pH 7.0～8.0，0.0 5 mol/L 磷酸；pH 9.0，0.05 mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸；pH 10.0，0.0 5 mol/L 硼砂-氢氧化钠；pH 11.0～14.0，0.2 mol/L 磷酸氢二钠-氢氧化钠。

2　结果与分析

2.1大西洋鲑鱼下脚料鱼粉主要成分

大西洋鲑鱼下脚料制备的鱼粉中含有大量的蛋白质和脂肪(表1)，可以进一步加工将其酶解制成抗氧化肽，以增大其综合利用价值以及水产养殖企业的经济效益，缓解水产加工原料不足的现状。

表1　大西洋鲑鱼下脚料鱼粉主要成分

2.2单因素试验结果

2.2.1最适反应pH的确定

图1显示，在特定的pH范围内，不同的酶呈现出各自的最高活性。粗酶液2个主要活性峰值在pH 2.0和9.0左右，这表明主要存在2种蛋白酶：最适pH 2.0左右的酸性蛋白酶(可能为胃蛋白酶)和最适pH 9.0左右的碱性蛋白酶(可能为胰蛋白酶)。

图1　pH对大西洋鲑鱼内源蛋白酶分解酪蛋白活性的影响

此外，在pH 6.0左右有一个小的波峰，推测可能为一种组织蛋白酶。这不同于杨春桥等[17]报道的大西洋鲑粗蛋白酶在pH 3.0和pH 7.5时酶活力出现波峰。原因可能是大西洋鲑鱼蛋白酶除了在传统的肝脏、胰脏、胃和肠外，还存在于幽门盲囊，杨春桥等[17]并没有针对幽门盲囊进行分析，而幽门盲囊在大西洋鲑内脏中占有很大的比重；另外，本研究在提取粗酶时将所有内脏混合后提取，多种酶混合后会产生相互作用，这也可能是不同的一个原因。

2.2.2最适反应温度的确定

由图2可知，大西洋鲑鱼内源蛋白酶的活力随温度的升高而增大，但是当温度进一步升高时，由于蛋白的热变性作用使得蛋白酶活力逐步降低[18]。在pH 2.0的条件下，内源蛋白酶在40～55 ℃之间酶活力较高，在50℃时达到最大值(39 857.57 U/mg)；在pH 9.0时，内源酶的最适温度为40℃，酶活力为21 100.45 U/mg。

2.2.3最适料液比的确定

在固定酶解温度40℃、pH 9.0、加酶量0.4 mL/50 mL(灭活与未灭活对比，下同)、酶解时间2 h的条件下进行酶解试验，考察不同料液比对发酵液总抗氧化活性和发酵液中氨基氮含量的影响。如图3所示，总抗氧化活性和氨基氮含量在料液比0.6 g/50 mL时分别为130.54 U/50 mL和1.365 mg/100 mL，均达到最大值，且有相同的增长趋势。

图2　温度对大西洋鲑鱼内源蛋白酶酶活力的影响

图3　不同料液比对总抗氧化活性和氨基氮含量的影响

水产品加工副产物利用内源酶水解的反应必须在水溶液中进行，因为蛋白酶必须溶解在相应的缓冲液中才能均匀分散在整个反应系统中，才能与底物接触，并对其发生作用，底物浓度过高会导致流动性差，阻碍酶与底物接触，使反应速率降低[19]。

2.2.4最适加酶量的确定

在固定发酵温度40℃、pH 9.0、酶解时间2 h、料液比0.6 g/50 mL的条件下，考察不同加酶量对总抗氧化活性和氨基氮含量的影响。由图4可知，随着加酶量的增加，两项指标也逐步增加，但当加酶量超过0.5 mL/50 mL时，增长趋势放缓。

图4　不同加酶量对总抗氧化活性和氨基氮含量的影响

分析认为，在加酶量为0.5 mL/50 mL时，酶与底物达到饱和，继续添加酶会导致竞争性抑制而降低反应速率，由此确定0.5 mL/50 mL为最佳加酶量。

2.2.5最适酶解时间的确定

在固定发酵温度40℃、pH 9.0、料液比0.6 g/50 mL、加酶量0.5 mL/50 mL的条件下，考察不同酶解时间对总抗氧化活性和氨基氮含量的影响。由图5可知，两项指标均随时间增加而呈现增长的总体趋势，但波峰时间不同。

图5　不同酶解时间对总抗氧化活性和氨基氮含量的影响

这是因为，当水解到一定程度，发生的酶解反应主要是前阶段蛋白质水解获得的肽进一步转化为小肽和氨基酸，表现为水解度的增大，而总抗氧化活性并不会显著增加，甚至可能会降低。综合考虑后确定最适酶解时间为5 h。

2.3正交试验优化结果

根据已知的单因素试验结果，应用正交试验对其酶解条件进行优化，以确定最佳酶解工艺条件。正交实验因素与水平见表2。以水解度和总抗氧化活性(简称“总抗”)为指标，对表1的正交设计方案进行分析，确定最佳反应条件。正交实验结果分析见表3、表4、表5。

表2　正交试验因素与水平L16(45)

注：A—温度，℃；B—加酶量，mL/50 mL；C—料液比，g/50 mL；D—pH；E—时间，h。下同

表3　正交试验方案与结果分析

表4　以水解度为指标的正交试验方差分析结果

表5　以总抗为指标的正交试验方差分析结果

用大西洋鲑鱼内源蛋白酶酶解大西洋鲑鱼下脚料制备鱼粉时，以水解度为指标，方差分析结果(表4)显示，5个因素对水解度均有显著性影响(P<0.05)。极差分析结果(表3)发现，因素的影响程度依次为pH、酶解时间、加酶量、料液比、温度；最佳实验组合为温度45℃、加酶量0.7 mL/50 mL、料液比0.5 g/50 mL、pH 9.0、酶解时间7 h。方差分析结果(表5)发现，温度、pH、酶解时间对总抗有显著性影响(P<0.05)，另外两个因素对结果的影响不显著。根据表3，因素的影响程度依次为pH、酶解时间、温度、料液比、加酶量；最佳实验组合为：温度35℃、加酶量0.7 mL/50 mL、料液比0.7 g/50 mL、pH 9.0、酶解时间7 h。上述两个最佳组合并未出现在正交表中，需要对其进行验证实验。采用两组优化工艺参数对大西洋鲑鱼下脚料进行酶解反应，鱼粉水解度分别为19.20%和15.00%，二者具有显著性差异(P<0.05)；总抗分别为178.97 U和258.29 U，二者具有显著性差异(P<0.05)。与表3中的数据比对发现，优化后的水解度最优实验组合比正交中的水解度提高了27.91%，总抗最优实验组合比正交方案中的总抗提高了51.78%。

3　结论

大西洋鲑内脏中至少含有三种蛋白酶：pH 2.0的酸性蛋白酶(可能为胃蛋白酶)，pH 9.0的碱性蛋白酶(可能为胰蛋白酶)，pH 6.0的一种组织蛋白酶。pH 9.0的酶活力最高，前两种蛋白酶的最适反应温度分别为50℃和40℃。在单因素实验基础上，使用正交法对酶解条件进行优化，两优化组在总抗氧化活性和水解度上都有所提高，确定影响发酵液总抗氧化活性的3个主要影响因素(P﹤0.05)为温度、pH和酶解时间。综合经济效益考虑，确定最佳反应条件为：温度35℃、加酶量0.7 mL/50 mL、料液比0.7 g/ 50 mL、pH 9.0、酶解时间7 h。在此条件下，酶解得到的酶解液，其总抗氧化活性为258.29 U，鱼干粉料水解度为15.00%。用大西洋鲑鱼内源蛋白酶处理大西洋鲑鱼下脚料制备抗氧化肽，具有一定的可行性，作为大西洋鲑鱼加工处理的一个环节，可增加其综合利用价值，具有生态效益和经济效益。

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Study on the optimal conditions for preparing antioxidant peptides from Atlantic salmon processing wastes using its endogenous proteases

CHEN Lin, LI Bingjun, FENG Junrong

(Schoolofocean,YantaiUniversity,Yantai264005,China)

The processing residues of Atlantic salmon (Salmosalar) contain abundant proteins and are of high value for further utilization, while abandoning them would be a waste of resources and might cause environmental pollution. Thus it is significant to research the preparation of antioxidant peptides from Atlantic salmon processing residues with its endogenous proteases. A preliminary study of proteases from Atlantic salmon viscera showed that there were mainly 3 types of endogenous proteases which were most active at pH value of 2.0, 6.0, and 9.0 respectively, and the alkaline protease with optimal activity at pH 9.0 had the highest specific activity level. Atlantic salmon processing residues protein were hydrolyzed by endogenous proteases to produce the antioxidative hydrolysates. The degree of hydrolysis and the total antioxidant activity were compared to find the best single factors; among the single factors studied,temperature, initial pH and time had significant effects on the total antioxidant activity of enzymatic hydrolysis solution (P<0.05), and the optimum hydrolysis conditions were determined by L16(45) orthogonal array design as follows: temperature 35°C, dosage of enzyme 0.7mL/50mL, material-to-solvent ratio 0.7g/50mL, pH value 9.0, and time 7h, under which the total antioxidant activity and degree of hydrolysis were 258.29U and 15.00%, respectively. In conclusion, it is feasible and practical to prepare antioxidant peptides from Atlantic salmon processing wastes using its endogenous proteases.

Salmosalar; endogenous proteases; enzymolysis; antioxidant peptide; orthogonal

10.3969/j.issn.1007-9580.2016.04.012

2016-05-21

2016-07-29

山东省科技发展计划项目(2012GHY11515)

陈琳(1987—)，男，硕士研究生，研究方向：水生生物学。E-mail：641584489@qq.com

李秉钧(1961—)，男，教授，研究方向：水产养殖学、遗传育种学、海洋生物技术。E-mail：li6234307@163.com

TS254.9

A

1007-9580(2016)04-064-06