郭伟良,王文慧,邓兴旺,胡文婷,谢珍玉,王世锋,周永灿

(热带生物资源可持续利用省部共建国家重点实验室培育基地海南大学海洋学院,海南海口570228)

响应面法优化一种抗无乳链球菌中药复方的浸提工艺研究

郭伟良,王文慧,邓兴旺,胡文婷,谢珍玉,王世锋,周永灿

(热带生物资源可持续利用省部共建国家重点实验室培育基地海南大学海洋学院,海南海口570228)

为了确定一种中药复方中抗无乳链球菌活性成分(ACAS)的最佳浸提工艺,以ACAS浸提得率为指标,采用单因素和Box-Behnken Design试验设计(BBD)结合响应面分析法(RSM)序贯优化中药复方ACAS浸提工艺.结果显示,ACAS最佳浸提工艺为:以80%乙醇水溶液为溶剂,按液料比16.48∶1(mL/g),39℃浸提2 h、浸提2次,在此最优条件下进行平行4次验证试验,ACAS浸提得率可达4.02%±0.15%,与预测值4.06%的相对误差为0.99%,是优化前40.2倍.为中药复方ACAS纯化鉴定、药理毒理分析等后续研究奠定了良好基础.

无乳链球菌;中药复方;响应面法;浸提工艺优化

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae,SA)是多种淡海水养殖鱼类的重要病原,尤其对罗非鱼等温水性鱼类危害严重[1].为防治该病,滥用和乱用抗生素等违禁药物时有发生,导致药物残留超标而严重影响养殖罗非鱼产品品质.中药因具有多功效、低毒、低残留、致病菌不易产生耐药性等优势而在水产病害防治中广泛使用[2].由于中药活性成分提取常涉及到药材多组分的多层次溶出,提取过程受多因素交互作用影响[3],仅采用简单的单因素试验方法难以精确定位中药最优提取工艺.Box-Behnken Design试验设计(BBD)结合响应面分析法(Response Surface Methodology,RSM)是集数学、统计学和计算机科学于一体的实验设计与优化方法,已广泛应用于生物、医药、化工、农业等领域[4].本文在作者前期建立的具有良好抗罗非鱼SA活性的马兜铃金银花复方(Compound of Aristolochic Debilis and Lonicera ja⁃ponica,CAL)基础上,采用BBD结合RSM方法,优化CAL中抗SA活性成分(Active Components Against Streptococcus agalactiae,ACAS)浸提工艺,为CAL中活性成分鉴定和防治罗非鱼链球菌病绿色新药的研发奠定基础.

1　材料与方法

1.1试验材料马兜铃与金银花饮片,购自海口市广安堂药品超市海甸分店.SA为本实验室从海南患病罗非鱼中分离鉴定和保存的致病菌株.

1.2试验方法

1.2.1样品预处理马兜铃和金银花分别于80℃烘箱中干燥2 h,用高速粉碎机粉碎后过60目筛,按照等质量比混匀而制成粉末CAL,待用.

1.2.2ACAS含量测定参照文献[5],琼脂扩散法测定ACAS含量标准曲线绘制.

以水为溶剂,液料比20∶1(mL/g),40℃浸提CAL 3 h,6 000 r/min离心10 min,上清液浓缩40倍作为母液.因ACAS未经分离纯化,其含量尚未得知,本文假定ACAS的初始浸提得率为0.1%,则母液的ACAS浓度为2.00 mg/mL,ACAS浸提得率计算公式(a):

将母液等梯度稀释成ACAS浓度范围为0.04～0.16 mg/mL的7个标准液,琼脂扩散方法测定各标准液的抑菌圈直径,以ACAS浓度对数作横坐标,抑菌圈直径作纵坐标,绘制标准曲线.曲线的回归方程为Y=7.163Lg(X)+12.54,相关系数(R2)为0.931.

将样品液稀释或浓缩至合适浓度,琼脂扩散法测定其抑菌圈直径,根据标准曲线回归方程计算ACAS浓度,按式(a)计算ACAS浸提得率.

1.2.3单因素法优化ACAS浸提工艺条件按照母液制备方法浸提ACAS,其他条件不变,分别考察浸提溶剂中乙醇体积分数、浸提次数、浸提时间、浸提温度和浸提液料比对ACAS浸提得率的影响,初步优化ACAS浸取工艺.

1.2.4BBD结合RSM方法优化ACAS热水浸提工艺条件在单因素试验的基础上,选取浸提时间、温度和液料比作为考察因素,进行3因素3水平的BBD设计试验,ACAS浸提得率作为响应值,RSM法分析获得CAL的ACAS浸提工艺最优条件.在最优条件下进行4次平行验证试验.

表1　浸提次数对ACAS浸提得率的影响

2　结果与分析

2.1单因素法优化CAL的ACAS浸提工艺采用单因素法优化CAL的ACAS浸提工艺.浸提溶剂中乙醇体积分数优化见图1:当乙醇体积分数为80%时 ACAS浸提得率达到最大,低于40%或高于80%ACAS浸提得率急剧下降.根据相似相溶原理推测ACAS的主要成分极性接近80%乙醇水溶液.采用80%的乙醇水溶液作为溶剂浸提3次,每次浸提ACAS得率见表1:第3次浸提浓缩10倍,琼脂扩散法仍未能检出ACAS,为此选择浸提次数为2次.浸提时间的优化见图2:浸提时间为2 h时ACAS浸提得率最高,延长至3 h时,ACAS浸提得率大幅下降,说明浸提2～ 3 h间可能ACAS某些不稳定成分分解,或有ACAS拮抗成分浸出,使部分ACAS活性受抑制.浸提温度的优化见图3:在30℃～50℃区间ACAS浸提得率稳定于较高的状态,高于50℃ACAS浸提得率迅速下降,说明ACAS中含有热不稳定性组分.浸提液料的优化见图4:液料比为20∶1时ACAS浸提得率最高,大于20∶1,ACAS浸提得率与液料比呈负相关,这可能是由于加大液料比增加ACAS拮抗成分溶出,降低浸提液的抗SA的活性.

图1　浸提溶剂对ACAS浸提得率的影响

图2　浸提时间对ACAS浸提得率的影响

2.2BBD结合RSM法优化ACAS提取工艺通过单因素试验结果分析,选择浸提时间2 h、温度40℃和液料比20∶1为中心点,进行3因素3水平BBD设计试验,试验因素水平设计见表2,结果列于表3,以ACAS浸提得率为响应值,采用SAS 8.02软件进行RSM拟合分析,获得多元二次回归模型为:Y=4.0126+0.002X1-0.1541X2-0.2340X3-0.0223X1X2-0.1178X2X3-0.07588X1X3-0.2063-0.6154-0.3248(b).

图3　浸提温度对ACAS浸提得率的影响

图4　液料比对ACAS浸提得率的影响

表2　响应面试验因素水平表

表3　响应面试验设计方案及结果

表4　响应面试验方差分析

回归模型的相关系数(R2)为0.9851,表明回归模型拟合度较好.其显著性分析结果(pr>F值= 0.005)表明模型显著可靠.采用t检验方法对模型各项进行显著性分析且绘制两两因素之间的响应曲面图.显著性分析结果见表4:浸提温度(X2)、液料比(X3)及3个考察因素的平方项对响应值有着极显著的影响,而浸提温度和液料比(X2X3)之间存在着显著的交互作用.两两因素之间的响应曲面见图5-图7:图5和图7中浸提时间(X1)截面抛物线跨度较小,说明其在考察区内对响应值的影响不显著;图6中的浸提温度(X2)和浸提液料比(X3)的截面抛物曲线跨度大,斜面较陡,表明浸提温度和浸提液料比在考察区内对响应值的影响显著.图5和图7的等高线近似于正圆型,表明浸提时间与浸提温度(X1X2)、浸提时间与浸提液料比(X1X3)它们之间影响不显著;图6中等高线呈椭圆形,且椭圆长短轴与XY正交坐标轴有一定角度,表明X2和X3之间有着较为显著的交互作用.

图5　Y=f(X1,X2)的响应面图和等高线图

采用单因素和BBD结合RSM序贯优化获得中药复方ACAS最优浸提工艺:提取溶剂的乙醇体积分数为80%、浸提2次、浸提时间2 h、温度39℃和液料比16.48∶1(mL/g),模型预测的ACAS最高浸提得率为4.06%,4次平行验证试验的平均ACAS浸提得率为4.02%±0.15%,与预测值的相对误差为0.99%,表明所建模型准确可靠.ACAS浸提得率比优化前提高40.2倍.

图6　Y=f(X2,X3)的响应面图和等高线图

图7　Y=f(X1,X3)的响应面图和等高线图

3　讨论

中草药具有低毒、低污染、低成本、多组分协同作用不易引起耐药和多功效等优势,在水产养殖动物病害防治研究与应用中潜力巨大.然而中草药在水产中应用多数是借鉴或沿用人用或禽畜用药经验,针对性不强,急需加强针对水产养殖动物病原的中草药筛选及其活性成分分离纯化鉴定、药理和毒理等一系列基础研究[6].

本文所用的中药复方包含金银花和马兜铃两味中草药,琼脂扩散法研究表明,两者具有协同抗SA的活性.其中,金银花具有抗菌消炎、清热解毒、抗病毒及免疫调节等功能.其主要抗菌活性成分有绿原酸等有机酸类、木犀草素等黄酮类、β-谷甾醇等甾醇类及挥发油等[7].马兜铃具有抗菌、抗肿瘤和抗炎等作用,其主要抗菌活性成分为挥发油和马兜铃酸等[8].由于马兜铃酸具有较强的肾毒性和致畸等副作用,本文作者采用琼脂扩散法考察马兜铃酸标准品对SA的抑制效果,结果显示,马兜铃酸无抗SA活性,说明马兜铃中抗SA活性物质可能是其挥发油成分.

中草药常以多组分多靶点协同抗菌,提取过程涉及多组分多层次的溶出,有些组分会发生物理或化学变化,影响活性.需寻找合适的优化方法精确提高中药活性成分提取得率.本研究以ACAS浸提得率为响应值进行CAL提取工艺的优化,最大限度地保留ACAS成分,降低非优化目标成分含量,提高活性,降低毒性.BBD以考察因素组成多维空间的中心点和因素边界的中点为试验点,各试验点连接形成球面或近似球面,适于以多元二次回归模型(RSM)来逼近响应值[9],可精确描述因素与响应值之间的全局函数关系,快速有效确定多因素系统的最优条件.BBD与RSM结合也能很好的描述提取因素与活性成分提取得率的函数关系,精确获得中药多活性成分体系的最优提取条件[10-12].本文在单因素试验基础上,以BBD结合RSM法获得了CAL中ACAS的优化浸提工艺,并确定了浸提因素之间、浸提因素与响应值之间的影响关系.最优浸提条件下ACAS浸提得率实测值与模型预测值相对误差仅为0.99%,表明所建模型准确可靠.本研究结果为中药复方活性成分的分离及CAL在防治罗非鱼SA病上的安全高效应用奠定了基础.

[1]Zhang D,Li A,Guo Y,et al.Molecular characterization of Strep⁃tococcus agalactiae in diseased farmed tilapia in China[J].Aqua⁃culture,2013,412:64-69.

[2]陈丽婷,郇志刊,王晓清,等.中草药添加剂在水产养殖中的应用研究进展[J].水产科学,2014,33(3):190-194.

[3]李有润,郑青.中草药提取过程的数学模拟与优化[J].中草药,1997,28(7):399-401.

[4]Ye C L,Jiang C J.Optimization of extraction process of crude polysaccharides from Plantago asiatica L.by response surface methodology[J].Carbohydrate Polymers,2011,84(1):495-502.

[5]邓恒为,郭伟良,孙晓飞,等.响应面法优化丹参中抗无乳链球菌活性成分的提取工艺[J].渔业科学进展,2014,35(4): 132-140.

[6]葛兵,陈林.中草药饲料添加剂的研究进展[J].畜牧与饲料科学,2010,31(3):29-31.

[7]赵良忠,蒋贤育,段林东,等.金银花水溶性抗菌物质的提取及其抑菌效果研究[J].中国生物制品学杂志,2006,19(2): 201-203.

[8]王瑛,潘竞先,贾忠建.马兜铃属植物化学成分及生物活性研究进展[J].天然产物研究与开发,2000,12(6):84-93.

[9]Gong W J,Zhang Y P,Zhang Y J,et al.Optimization strategies for separation of sulfadiazines using Box-Behnken design by liq⁃uid chromatography and capillary electrophoresis[J].Journal Cen⁃tral South University of Technology,2007,14(2):196-201.

[10]逯家辉,李国庆,张华飞,等.八角茴香油提取工艺优化[J].农业工程学报,2008,24(6):254-257.

[11]常星洁,刘汉清,邹建荣,等.响应面发优化女贞子有效成分的提取工艺[J].中成药,2012,34(5):839-842.

[12]张慧,谭秋龙,黎行山,等.结合响应面分析法优化复方金钱草君药的半仿生提取工艺[J].广东药学院学报,2013(1): 132-133.

Optimizing theextraction procession of activecomponents againstStreptococcus agalactiaefrom Chineseherbal compound using Responsesurfacemethodology

GUO Wei-liang,WANG Wen-hui,DENG Xing-wang,HU Wen-ting,XIE Zhen-yu,WANG Shi-feng,ZHOU Yong-can
(State Key Laboratory Breeding Base for Sustainable Exploitation of Tropical Bio-resources College of Marine science,Hainan University,Haikou 570228,China)

To optimize the extraction process of the active components against Streptococcus agalactiae(ACAS)from the Chi⁃nese herbal compound,Single-factor experiments and the combination of Box-Behnken Design(BBD)and response surface analy⁃sis(RSM)were sequentially applied with ACAS extraction rate as the criterion.Results showed that the optimum ACAS extraction process was as follows:the extracting solvent was 80%ethanol water solution,extracting times was twice,extraction time was 2 h,extraction temperature was 39℃and the ratio of liquid to material was 16.48:1(mL/g).The verification experiments in 4 parallels with the optimum extraction conditions were carried out and the ACAS extraction rate reached 4.02±0.15%,which was 40.2 times of the value before optimization.The relative error between the predictive and actual values was 0.99%.Our data make the basis for ACAS further study such as purification,identification,pharmacology,toxicology,and so on.

Streptococcus agalactiae;Chinese herbal Compound;Response Surface Methodology;Optimization of the ex⁃traction procession

ZHOU Yong-can

S943

A

0529-6005(2016)06-0107-04

2015-03-23

高等学校博士学科点专项科研基金(20124601110-006);农业部渔用药物创制重点实验室开放课题(201408);海南省重大科技项目(ZDZX2013009);海南省产学研一体化专项资金项目(CXY20130058);海南自然科学基金(20153050)和海南大学地方服务项目共同资助

郭伟良(1983-),男,讲师,博士,研究方向为中草药在水产养殖病害中的应用研究,E-mail:guowl07@mails.jlu.edu.cn

周永灿,E-mail:zychnu@163.com