杨彩霞,张　冰,宁鹏飞,黄程程,孙　磊,高　雁,姜维胜,刘明春

(1.沈阳农业大学畜牧兽医学院,辽宁沈阳110866;2.辽宁农牧业机械研究所有限公司,辽宁沈阳110036;3.沈阳禾丰反刍动物饲料有限公司,辽宁沈阳110164)

辽宁地区奶牛临床型乳房炎大肠杆菌的血清型及耐药性调查

杨彩霞1,张冰1,宁鹏飞1,黄程程1,孙磊1,高雁2,姜维胜3,刘明春1

(1.沈阳农业大学畜牧兽医学院,辽宁沈阳110866;2.辽宁农牧业机械研究所有限公司,辽宁沈阳110036;3.沈阳禾丰反刍动物饲料有限公司,辽宁沈阳110164)

对辽宁地区16家规模化奶牛场总计1 609头泌乳期奶牛临床型乳房炎进行了调查,并对患病奶牛乳样进行大肠杆菌的分离、鉴定及药物敏感性试验.结果奶牛临床型乳房炎头发生率为6.96%,乳区发生率为2.35%;共分离鉴定出84株大肠杆菌,分离率为55.63%;血清型鉴定结果表明O51、O148、O60、O21、O77、O17、O6、O158、O101、O12510个血清型为优势血清型.采用肉汤微量稀释法测定21种临床常用抗菌药物对84株大肠杆菌分离株的最小抑菌浓度(MICs),表明分离菌对磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲基异噁唑、甲砜霉素高度耐药;对氧氟沙星、环丙沙星、庆大霉素较敏感.

奶牛乳房炎;大肠杆菌;血清型;耐药性

乳房炎是由乳腺感染、外伤或化学刺激而引起的乳房炎性反应,乳腺感染在生产上比较常见,即由某些病原微生物感染乳腺组织而导致的乳房炎症.乳房炎分为临床型和隐性型,是致使全世界牛场经济损失最严重的疾病.已发现约有150多种病原菌能够引起奶牛乳房炎[1],其中主要是链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、隐秘杆菌和绿脓杆菌等.现阶段国内外仍主要采用抗菌药物治疗奶牛乳房炎.但是随着抗菌药物的广泛及长期的不合理应用,使得病原菌产生了很强的耐药性,耐药菌株逐年增多,多药耐药现象越来越严重.本试验对辽宁地区奶牛进行了临床型大肠杆菌的分离、鉴定和药物敏感性试验,以期为辽宁地区奶牛乳房炎的有效防治提供理论依据.

1　材料与方法

1.1材料营养肉汤(NB)、营养琼脂、麦康凯琼脂,均购自北京奥博星生物技术责任有限公司;大肠杆菌ATCC25922,购自中国兽医药品监察所菌种保藏中心;肠杆菌科生化常规鉴定管,购自杭州天和微生物试剂有限公司;药敏试验用药标准品和大肠杆菌"O"抗原定型血清,均购自中国兽医药品监察所.

1.2方法

1.2.1乳样的采集分别采集辽宁省不同地区的16家奶牛场临床型乳房炎奶牛的乳样.牛只按常规挤奶消毒后,每个乳头挤去头2～3把乳后无菌采集乳样3 mL左右于灭菌的塑料离心管中,做好标记,放于含冰袋的保温箱中,尽快运至实验室待检.

1.2.2大肠杆菌分离与鉴定将乳样涂抹于麦康凯培养基中,置37℃恒温箱培养24 h后观察,根据菌落形态初步判定细菌类属.将初步分离的病原菌接种于肠杆菌科生化常规鉴定管中,孵育18 h～24 h后观察结果,根据鉴定结果编码鉴定手册判定细菌种类.

1.2.3血清型鉴定采用玻板凝集反应和试管凝集反应,具体操作和判定按照大肠杆菌"O"抗原定型血清使用说明书进行.

1.2.4药敏试验采用肉汤微量稀释法测定21种药物对大肠杆菌分离株的MICs,测定方法及判断标准参照2013年美国临床和实验室标准化研究所的标准[2].

2　结果与分析

2.1辽宁地区奶牛临床型乳房炎调查结果对辽宁地区16家规模化奶牛场的1 609头泌乳期奶牛进行临床型乳房炎流行病调查.共检测出112个临床型乳房炎病例,采集了临床型乳房炎样品151份进行大肠杆菌病原分离鉴定,临床型乳房炎头发生率为6.96%,乳区发生率为2.35%.

2.2辽宁地区奶牛临床型乳房炎大肠杆菌分离鉴定结果挑取在麦康凯鉴别培养基上呈粉红色带金属光泽的菌落,经过染色镜检、生化鉴定,共鉴定出84株大肠杆菌,分离率为55.63%.

用大肠杆菌"O"抗原定型血清对大肠杆菌分离株进行"O"型鉴定,共鉴定出59株分离菌的血清型,占分离菌的70.2%.其中大部分菌株具有1～2种血清型,少数具有多种血清型,共鉴定出24种血清型.其中以O51、O148、O60、O21、O77、O17、O6、O158、O101、O12510个血清型为主,共35株,占已定型血清的59.3%.

2.3大肠杆菌分离株药物敏感性试验结果21种抗菌药物对84株奶牛乳房炎大肠杆菌的MIC值见表1.大肠杆菌分离株对磺胺类药物耐药率最高,其中对磺胺间甲氧嘧啶100.0%耐药,对磺胺甲基异噁唑的耐药率达98.8%;对甲砜霉素、土霉素的耐药率也高达94.0%和80.9%;对阿莫西林、氨苄西林、乙酰甲喹、多西环素相对敏感;对喹诺酮类药物敏感率最高,尤其对氧氟沙星的敏感率高达97.6%.

表1　奶牛乳房炎大肠杆菌分离株对21种抗菌药物的耐药情况

2.4辽宁地区奶牛临床型乳房炎大肠杆菌耐药谱分析进行药敏试验的21种抗菌药物分属10类,其中青霉素类2种,头孢菌素类2种,四环素类3种,氨基糖苷类3种,酰胺醇类3种,喹诺酮类3种,磺胺类2种,大环内酯类、多肽类和喹噁啉各1种.药敏试验表明,同类药物之间存在着不同程度的交叉耐药现象.因此从每类药物中选出一个代表,即氨苄西林(a)、头孢噻呋(c)、四环素(t)、庆大霉素(g)、氟苯尼考(f)、恩诺沙星(e)、磺胺间甲氧嘧啶(s)、阿奇霉素(z)、多黏菌素(p)、乙酰甲喹(m),共计10类,分析统计辽宁地区奶牛临床型乳房炎大肠杆菌对这10类抗菌药物的耐药情况(详见表2).辽宁地区奶牛乳房炎大肠杆菌有46种耐药谱,以s耐药谱菌株最多,达16.7%.多药耐药情况严重,最多耐受8类抗菌药物.

表2　辽宁地区奶牛乳房炎大肠杆菌对10类抗菌药物的耐药谱

3　讨论

据报道,呼和浩特[3]、江苏[4]、西安[5]地区奶牛临床型乳房炎头发生率分别为50.4%、7.2%、4.37%.从本试验调查结果得知,辽宁地区奶牛临床型乳房炎头发生率相对较低.本研究发现,大肠杆菌为辽宁地区奶牛临床型乳房炎的主要致病菌,其分离率(55.63%)与宁夏[6]地区大肠杆菌的分离率(65.3%)相近,高于长春[7]、山东泰安[8]等地区大肠杆菌的分离率,也高于Su等[9]人的报道.本试验中分离鉴定的大肠杆菌以O51、O148及O60等10个血清型为主,占已定型血清的59.3%.已定型的59株菌包含了24种血清型,表明大肠杆菌血清型具有复杂性和多样性.84株分离菌株对磺胺类药物、甲砜霉素、土霉素等耐药率较高,但对氨基糖苷类药物敏感性相对较高,对喹诺酮类药物敏感率最高.本研究结果与四川、内蒙和上海地区的报道结果基本一致[10-11].

本试验采样的16家奶牛场分属于沈阳、锦州、阜新、盘锦四个地区.不同地区的奶牛乳房炎头发生率有所不同,阜新较高(20.17%),沈阳(7.30%)、锦州(3.45%)、盘锦(6.64%)较低;阜新地区的大肠杆菌分离率(62.5%)也最高.大肠杆菌血清型复杂,未见其分布规律.各个地区的耐药表型没有明显差异,均对磺胺类药物和甲砜霉素高度耐药,对喹诺酮类100%耐药,对氯霉素,庆大霉素高度敏感.说明各地区可能存在相似的用药习惯,建议加强对临床用药常识的普及,避免抗菌药物的不合理使用,以避免新的耐药菌株的产生,并根据药敏试验结果指导临床科学合理使用抗菌药物.

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S852.61

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0529-6005(2016)06-0092-02

2015-04-16

辽宁省科学技术厅科技特派、农民技术员培训项目(2013030055-201)

杨彩霞(1989-),女,硕士生,主要从事兽医药理与毒理学的研究,E-mail:yang_chaixia@163.com

刘明春,E-mail:liumingchun@sina.com