四川地区猪沙门菌的分离鉴定及其耐药性分析

2016-09-08刘海燕王远微杨发龙

中国兽医杂志 2016年6期

刘海燕,侯　巍,王远微,杨发龙

(1.成都农业科技职业学院,四川成都611130;2.四川省动物疫病预防控制中心,四川成都610041; 3.西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;4.西南大学食品科学学院,重庆北碚400715)

刘海燕1,侯巍2,王远微3,4,杨发龙3

为了解四川地区规模化养猪群的沙门菌的带菌情况,采用病原菌的形态学观察、生化鉴定、血清学鉴定和PCR鉴定方法对采自四川10个规模化猪场的600份健康猪粪便进行了沙门菌分离鉴定,并对鉴定出27株沙门菌进行了药物敏感性试验和耐药分析.结果表明,来自四川地区的10个健康猪群的沙门菌总检出率为4.5%(27/600);各个市县的沙门菌的分离率介于1.7%～6.7%之间;分离到沙门菌对四环素、复方新诺明以及氟苯尼考的耐药率分别为96.3%、96.3%和92.6%,耐药率大于85%的药物有氨苄西林、奥格门丁、卡那霉素和恩诺沙星,庆大霉素(74.1%)和大观霉素(77.8%)的耐药率也比较严重,头孢噻呋、头孢唑啉、达氟沙星和多黏菌素E是较为敏感的药物.

猪;沙门菌;分离鉴定;耐药性

沙门菌(Salmonella)是重要的人兽共患病之一的病原,可引起人和动物多种不同临床表现的发病,是人类食物中毒的主要病原之一.它不但影响畜牧业的健康发展,而且严重威胁人民的身体健康.注射或者饲料添加抗生素是目前全世界各国防治沙门菌疾病的主要方式,但近年来临床抗生素的滥用以及饲料中的添加造成了沙门菌的严重耐药[1].若不能及时研究并解决沙门菌耐药猪场的沙门菌感染问题,会给沙门菌病的预防及控制造成巨大的困难.

本文对四川各市县规模化养猪场进行了沙门菌的分离鉴定,了解四川地区猪沙门菌的流行情况及耐药特征,为该地区猪沙门菌病的科学防治提供理论依据.

1　材料与方法

1.1样本采集从2014年8月至2014年12月,分别在四川省各地区的10个规模化猪场,用棉拭子采集临床健康猪直肠粪便样本,60份/猪场,不同生长周期(哺乳期、保育期、生长期)各采集20份,共600份.

1.2培养基及主要试剂科玛嘉沙门菌显色培养基,郑州博赛生物技术股份公司;多价菌体(O)抗血清,杭州天和微生物试剂有限公司;Taq DNA聚合酶、DNA Markers、dNTPs,TaKaRa公司;琼脂糖,Oxoid公司;沙门菌参考菌株以及药敏质控菌株ATCC25922均由西南民族大学动物医学实验室保存提供.

1.3细菌的分离培养与形态观察将采集的样本接种到BPW增菌液中,于37℃培养箱中增菌24 h,然后取1 mL转种到TTB选择性增菌液中,42℃,培养24 h.然后将增菌液分别接种于科马嘉显色培养基和S.S.培养基上,于37℃培养箱中培养24 h.挑取S.S.培养基和科马嘉显色培养基上的疑似菌落,按照常规方法进行革兰染色镜检,观察菌体的形态、大小.

1.4生化鉴定挑取纯化新鲜培养物接种于微量生化反应管中,于37℃培养箱中培养18 h,对照生化编码手册进行鉴定.

1.5血清学鉴定采用沙门菌A-F多价血清玻板凝集试验对符合沙门菌生化特性的阳性菌株做血清学鉴定,其操作遵循产品使用说明书.

1.6PCR鉴定选取Rahn K等[8]研究报道的扩增沙门菌属invA基因特异性片段的引物,目的片段大小284 bp,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,其序列如下:P1:5′-GTGAAAT⁃TATCGCCACGTTCGGGCAA-3′,P2:5′-TCATCG⁃CACCGTCAAAGGAACC-3′;对以上鉴定为阳性的菌株进行PCR扩增,反应条件和反应体系见文献.

1.7药敏试验采用最小抑菌浓度(MIC)方法评价分离菌株的耐药情况.用大肠杆菌ATCC25922作为质控菌株,设立只有菌液没有药液的阳性对照组和不含药液和菌液的阴性对照组.

2　结果与分析

2.1细菌的分离培养从采集的600份样本中分离到疑似沙门菌47株,染色镜检均为革兰阴性短小杆菌、大小均一、多散在、无芽抱、无荚膜.S.S.平板上的菌落较小、无色透明或中间黑色周围无色透明、边缘整齐、光滑凸起;科玛嘉显色培养基上为紫红色的菌落.

2.2生化鉴定结果镜检的47株疑菌中有35株细菌符合沙门菌生化特征.35株分离菌能分解葡萄糖、甘露醇、麦芽糖,产酸产气;不利用乳糖和蔗糖;能利用枸橼酸盐;不分解尿素;甲基红试验阳性;硫化氢试验产生H2S.

2.3血清学鉴定结果符合生化特性的35株疑似菌中有30株细菌与沙门菌A-F多价血清发生了凝集反应.

2.4PCR鉴定结果对分离出的30株疑似沙门菌进行PCR鉴定,其中27株细菌扩增得到invA基因大小为284 bp的片段,与预期目的片段大小相同,部分结果见图1.随机抽取5株细菌的扩增片段产物进行克隆测序,结果显示与GenBank中沙门菌的invA基因同源性为100%,证明所扩增序列正确.

2.5健康猪沙门菌携带率用生化试验、血清学试验结合PCR检测对四川省各地区采集的600份样本进行沙门菌的分离鉴定.共分离到27株沙门菌,检出率为4.5%(27/600).各地区猪场的检出率见表1.

表1　四川不同地区10个猪场沙门菌的检出率

2.6药敏试验结果当阳性对照组细菌明显生长,阴性对照组无细菌生长时,以实验组孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC值.以MIC值位于美国临床试验室标准化委员会标准的敏感(susceptible,S)、中介(intermediate,I)、耐药(resistance,R)分界点值范围判断结果.27株待检沙门菌对14种抗生素表现出不同程度的耐药,结果见表2.对氨苄西林、卡那霉素、大观霉素、四环素、奥格门丁、庆大霉素、氟苯尼考、复方新诺明、恩诺沙星等抗生素的耐药率比较高,从74.1%到96.3%.对头孢噻肟、多黏菌素E和头孢唑啉比较敏感.

图1　沙门菌invA基因PCR检测

表2　沙门菌对14种抗生素的耐药情况

3　讨论

本试验从四川各市县规模化养猪场采样,通过生化试验、血清学试验以及PCR试验,共分离鉴定出27株沙门菌.由于生化试验存在一定的误差,而沙门菌与志贺菌以及大肠杆菌均有一定的交叉抗原,因而血清学试验结果也不能作为完全的判定标准.PCR鉴定方法是目前比较稳定和公认的鉴定方法,结合生化和血清学鉴定结果比较准确.现在大量关于鉴定沙门菌属特异性引物被报道.但在2003年Malorny等人用43种不同血清型沙门菌和47种非沙门菌对4种沙门菌特异性引物进行比较,发现仅invA基因引物可以检出全部沙门菌,仅在一些大肠杆菌和枸橼酸杆菌中invA基因会扩增出非特异性条带,由于与目的条带大小差距较大,不会影响结果判断,其余3对引物均有漏检[2].因此本研究选择invA基因引物作为鉴定引物.

本试验沙门菌总分离率为4.5%(27/600),低于加春生[2]等对哈尔滨地区猪沙门菌的检出率5.83%(35/600)以及张玮[4]对安徽省6个地区猪场沙门菌的检测结果6.11%(22/360).这可能是不同地区猪场抗生素的添加种类及添加量不同引起的.此外,除绵阳和乐山两地区的分离率略高于其他地区之外,其他8个地区的分离率都相对较低,这可能是四川是养猪大省,猪场的饲养管理,特别是沙门菌的控制做得较好.

药敏试验显示,分离的猪源沙门菌对于氨苄西林、奥格门丁、庆大霉素、卡那霉素、恩诺沙星、四环素、氟苯尼考以及复方新诺明都有耐药性,甚至对氟苯尼考的耐药率达92.6%、对四环素和复方新诺明的耐药率达到96.3%,这可能与饲料中长期添加磺胺类药物、氯霉素以及四环素类抗菌素有关;而对头孢唑啉、达氟沙星敏感,对头孢噻呋、多黏菌素E较为敏感,提示可以使用以上药物进行治疗.当前,抗生素滥用导致耐药性普遍存在,从本试验结果看出,虽然四川省沙门菌检出率较低,但是耐药性仍然存在,要彻底消灭该病,必须淘汰带菌猪,建立无菌猪群,消灭传染源,切断垂直传播途径.在人们高度关注食品安全的今天,沙门菌这一食源性疾病,必须引起高度重视.

[1]加春生,毛泽明,王晓楠,等.猪沙门菌的分离鉴定及其耐药性分析[J].东北农业大学学报,2014,45(8):49-54.

[2]任学兵,汤德元,杨泽平,等.猪沙门菌耐药性的研究进展[J].猪业科学,2009,12:36-39.

[3]Malorny B,Hoorfar J,Bunge C,et al.Multicenter Validation of the Analytical Accuracy of Salmonella PCR:towards an International Standard[J].Applied and Environmental Microbiology,2003,1(69): 290-296.

[4]张玮.安徽省部分猪场生猪沙门菌带菌情况与耐药性研究[D].合肥:安徽农业大学,2010:56-58.

Identification and resistanceofSalmonellaisolated from pigs of Sichuan province

LIU Hai-yan1,HOU Wei2,WANG Yuan-wei3,4,YANG Fa-long3
(1.Chengdu Agricultural College,Chengdu 611130,China;2.Animal disease prevention and control center of Sichuan province,Chengdu 610041,China;3.College of Life Science and Technology,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China;4.College of food Science,Southwest University,Chongqing 400715,China)

27 Salmonella strains were isolated from 600 feces in the rectal of pigs from the large-scale pig farms of Sichuan province by morphological observation,biochemical system,serological identification and polymerase chain reaction.Antimicrobial susceptibility test and drug resistance of 27 strains to 14antibacterial were performed by Krby-Bauer method.The results showed that the overall detection rate of Salmonella was 4.5%and the total rate of separation was from 1.7%to 6.7%in the different cities of Sichuan.The resistant rate of 27 strains to tetracycline,sulfamethoxazole,florfenicol,ampicillin,augmentin,kanamycin,enroflox⁃acin,gentamicin,and spectinomycin was 96.3%,96.3%,92.6%,88.9%,88.2%,85.2%,85.2%,74.1%and 77.8%,respectively. However,they were sensitive to cefotaxime,cefazolin,danofloxacin and polymyxin e.The findings show that Salmonella infections exist in pig farms in Sichuan and the antimicrobial resistance of Salmonella is very severe.

pig;Salmonella;isolation and identification;resistance

YANG Fa-long

S852.61+2

0529-6005(2016)06-0086-03

2015-09-10

"十二五"高技术研究发展计划(863计划)(2012-AA101304)

刘海燕(1979-),女,讲师,硕士,从事病原微生物研究,E-mail:280170380@qq.com

杨发龙,E-mail:yfalong@hotmail.com