陆　淳,张　鑫,吴剑平,严　凤,顾　欣

(上海市动物疫病预防控制中心,上海长宁201103)

抗病毒药物在动物组织中残留检测方法进展

陆淳,张鑫,吴剑平,严凤,顾欣

(上海市动物疫病预防控制中心,上海长宁201103)

金刚烷类、神经氨酸酶抑制剂、核苷类以及广谱类的抗病毒药物都曾被报道用于兽医临床治疗病毒感染[1],我国农业部2005年发出《关于清查金刚烷胺等抗病毒药物的紧急通知》要求禁止生产、经营和使用金刚烷胺等抗病毒药物,美国FDA于2006年禁止金刚烷类和神经氨酸酶抑制剂类抗流感病毒药物用于禽类,但近年来为预防禽流感,抗病毒药物在畜禽养殖环节有滥用现象,2012年的"速成鸡"事件中检出鸡肉中残留有金刚烷胺和利巴韦林,给我国家禽养殖业带来严重的负面影响.抗病毒药物在畜禽养殖业的非法使用屡禁不止,而国内外对动物组织中的抗病毒药物多残留的检测方法研究较少,这给此类药物的监管带来了不便,研究建立同时检测多种抗病毒药物残留量的检测方法,对于有效监控该类药物的使用、保障我国动物性食品安全具有重要的意义.本文在参考国内外文献的基础上,结合自身工作实际,对目前常见四类8种抗病毒药物残留的LC/MS/MS检测方法进行综述,为监测部门提供参考.

1　抗病毒药物的分类和机理

抗病毒药在某种意义上说是病毒抑制剂,不能破坏病毒体,也不会损伤宿主细胞.抗病毒药的作用在于抑制病毒的繁殖,使宿主免疫系统抵御病毒侵袭,修复被破坏的组织,缓和病情使之不出现临床症状.本文关注的8种常用的抗病毒药物分类及其作用机理各不相同.

1.1金刚烷胺类抑制病毒复制初期的药物,阻断病毒基因的脱壳即阻断病毒核酸进入宿主细胞,达到治疗和预防病毒感染疾病的目的,常见的有:金刚烷胺(Amantadine,ATD),金刚乙胺(Rimantadine,RTD),美金刚胺(Memantine,MMT)等.

1.2神经氨酸酶抑制剂类神经氨酸酶是流感病毒颗粒表面的一种由蛋白构成的酶,是病毒复制和扩散所最关键的酶,通过抑制神经氨酸酶的活性,阻止子代病毒颗粒在宿主细胞的复制和释放,可明显缩短流感的持续时间,如奥司他韦(Os⁃eltamivir,OSTV)等.

1.3核苷类在病毒复制过程中,药物竞争性地与病毒DNA聚合酶或RNA聚合酶相结合,从而抑制酶活性,干扰病毒核酸的合成,产生抗病毒作用,常见的有:利巴韦林(Ribavirin,RBV),阿昔洛韦(Acy⁃clovir,ACLV),更昔洛韦(Ganciclovir,GCLV)等. 1.4广谱抗病毒类对流感病毒等多种病毒增殖期的各个环节都有作用,如吗啉胍(Moroxy⁃dine,MXD)等.

2　抗病毒药物的化学性质

抗病毒药物的水溶性(LogS)、水油分配系数(LogP)、解离系数(pKa)的理论值见表1,8种抗病毒药物的水溶性和酸碱性不同,其中金刚烷胺、金刚乙胺和美金刚胺的性质接近,均为极性中等,碱性化合物,易溶于甲醇和酸性水溶液,可在反相色谱柱上保留:利巴韦林、阿昔洛韦和更昔洛韦为两性化合物,极性较大,易溶于水溶液,难在反相色谱柱上保留:吗啉呱为碱性化合物,易溶于水,难在反相色谱柱上保留:奥司他韦为两性化合物,易溶于甲醇,可在反相色谱柱上保留.

表1　8种抗病毒药物的溶解度参数及解离系数

3　抗病毒药物在动物体内的残留情况

不同的抗病毒药物在体内的代谢途径及代谢产物均不相同,总体来看,8种抗病毒药物在动物体内均有原型存在,但含量高低不同.金刚烷胺90%以原型排出,金刚乙胺可产生多种代谢产物,包括间羟基化代谢物、2个对羟基代谢物的差向异构体,以及它们与葡萄糖醛酸的结合物等[2-3].利巴韦林在动物体内以原药、单磷酸酯(RMP)、二磷酸酯(RDP)和三磷酸酯(RTP)等形式存在,其中以原型和RMP的代谢形式占多数[4-5].阿昔洛韦、更昔洛韦主要以原型经肾排泄.吗啉胍可广泛分布于鸡的体液与组织,主要是在肝脏中进行乙酰化形成无活性的代谢产物,经肾排泄[6].奥司他韦在胃肠道被迅速吸收,经肝脏或肠壁酯酶迅速转化为活性代谢产物奥司他韦羧酸盐,至少75%的口服剂量以活性代谢产物、少量以原型的形式进入体内循环.

有学者[12]讨论了利巴韦林的原型及代谢物的检测方法,发现酶解后鸡肉中利巴韦林残留量上升,本课题组将0.1%利巴韦林以饮水方式饲喂鸡两周,在鸡肉中检出较高浓度的利巴韦林原型,作为畜禽养殖禁用药,检出原型即可满足监管要求,因此在实际监测工作中,可不采用酶解,简化检测步骤,节省工作时间.

4　抗病毒药物残留的前处理方法

抗病毒药物的作用机理和理化性质各异,传统前处理方法具有一定选择性,药物回收率不一致,且动物组织中药物残留量低,经过复杂的提取净化去脂步骤后,回收率不高,目前的文献报道[7-12]检测鸡肉中的抗病毒药物残留的方法多局限与某一类抗病毒药物,对多种抗病毒药物残留的同时检测报道较少,通常采用直接提取法、QuEChERS法、固相萃取柱法、固相萃取柱串联法、柱切换法等进行检测.其中直接提取法杂质去除不够充分、QuEChERS法对部分药物有吸附,柱串联法、在线净化法等是比较新颖的思路,值得探索.

4.1直接提取法目前在动物组织中金刚烷胺类残留量的检测方法主要采用直接提取法[7-8].本课题组使用酸性水溶液或酸性乙腈直接提取可以提取出所有药物,但稀释倍数较大,酸性乙腈提取后可氮吹浓缩,浓缩倍数增加的同时,基质干扰也较大,因此对于多残留检测,直接提取法并不适用.

4.2QuEChERS法QuEChERS法是基于固相萃取和基质固相分散技术的快速前处理方法,近期在兽药残留分析领域有较多应用,有学者将其用金刚烷胺和氟喹诺酮类的同时提取净化,取得较好效果[9].本课题组尝试将其用于8种抗病毒药物的同时提取,发现在酸性乙腈直接提取的基础上加入C18粉和PSA会使基质得到净化,但同时导致药物回收率有一定降低.

4.3固相萃取柱法采用SPE小柱可实现多种抗病毒药物的同时提取净化,并在净化和浓缩方面均有较好效果[13],但问题的关键在于难以将金刚烷类和核苷类同时获得较好的分析[14],且8种药物的性质差异较大,因此选用单一固相萃取柱无法将全部药物都保留.

4.4固相萃取柱串联法有学者[15]尝试了HLB固相萃取柱和PBA固相萃取柱串联使用,通过反相保留机理,将大部分中等极性和非极性的物质保留在HLB柱上,目标分析物利巴韦林在HLB上不保留,进而流过HLB柱,在PBA柱上发生萃取吸附作用,进而实现了净化和富集,该思路适用于目标较单一的药物残留分析.本课题组[16]通过考察不同固相萃取柱对药物的保留和吸附性质,利用MCX和Hypercarb可分别实现对部分药物的富集净化的特性,将MCX固相萃取柱和Hypercarb固相萃取柱串接使用,实现了对8种抗病毒药物的同时富集净化,取得较好的效果.

4.5在线净化法有学者[10]采用甲醇-1%三氯乙酸或乙腈提取动物源食品中金刚烷胺,提取液用阳离子交换在线净化柱(Cyclone MCX)净化,5%氨水-甲醇溶液将分析物洗脱转入至Capcell Pak MG C18分析柱,经色谱分离后,用串联质谱检测,取得较好回收率,但对于多种抗病毒药物残留分析的适用性有待考察.

综上,由于8种抗病毒药物的性质差异较大,传统的、单一的方法难以实现同时提取、分析,可考虑采用固相萃取柱串联法,充分去除基质干扰,并使得溶剂能够匹配LC/MS/MS的检测.

5　抗病毒药物残留检测的仪器方法

国外有学者[17]在使用SXC固相萃取柱串接PBA固相萃取柱对鸡肉进行净化后,通过在线的柱切换使得7种目标药物分别在C18色谱柱和石墨化碳Hypercarb色谱柱上保留,实现多种抗病毒药物的同时分析.综合文献报道,本课题组比较了4种色谱体系:亲水色谱柱(HILIC)、反相色谱柱(HSS T3)、正相色谱柱(BEH Amide)、石墨化碳色谱柱(Hypercarb),采用不同的色谱柱和流动相体系,会影响药物的保留时间、出峰顺序、响应值等,在反相柱体系中,利巴韦林和阿昔洛韦保留不佳,在1.2 min出峰,易受杂质峰干扰:在亲水色谱柱和正相色谱柱体系中金刚烷胺,金刚乙胺,美金刚胺,吗啉胍,奥司他韦均在1.5～1.8 min出峰,易受杂质峰干扰:在石墨化碳色谱柱体系中获得了较满意结果.

6　结论

我国禁止生产、经营和使用抗病毒药物用于畜禽养殖,抗病毒药物的种类繁多,作用机理各不相同,代谢物形式较多,残留在动物体内的抗病毒药物及其代谢物对人类健康造成隐患,目前抗病毒药物的残留检测是畜禽产品质检领域的难点和热点问题,本文综述了基于LC/MS/MS对多种抗病毒药物同时检测的方法,发现问题的难点在于:(1)动物组织中8种药物的同步提取,固相萃取柱串联法是目前最好的解决方法;(2)8种药物在色谱柱上保留和分析,Hypercarb色谱柱能实现对药物的较好保留;(3)动物组织中的抗病毒药物残留形态较多,可将原型作为检测目标以简化操作.

通过深入分析了解抗病毒药物的性质和检测方法,为实现对抗病毒药物在畜产品质量领域的有效监控、杜绝抗病毒药物的非法使用提供技术支持.

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A

0529-6005(2016)06-0066-03

2015-10-21

上海市市级农口系统青年人才成长计划[沪农青字(2014)第2-5号];上海市科技兴农重点攻关项目[沪农科攻字(2013)第6-9号]

陆淳(1959-),男,高级兽医师,本科,研究方向为兽药及饲料检测,E-mail:m13032160666@163.com

张鑫,E-mail:xin_zh@yeah.net