王定发,周璐丽,周　雄,周汉林

(中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所,海南儋州571737)

5种植物提取物对猪致病菌的体外抗菌研究

王定发,周璐丽,周雄,周汉林

(中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所,海南儋州571737)

本试验旨在采用气相色谱-质谱联机法对5种植物提取物进行成分分析,并采用试管倍比稀释法研究其对猪大肠杆菌、猪金黄色葡萄球菌的体外抑菌效果.结果表明,5种植物提取物的共有成分和主要成分为洋芹脑、吉马烯D、β-石竹烯、胡椒酮、α-蒎烯、4-萜烯醇、天然维生素E,且其对猪两种致病菌均有较好的抑制作用,其中广西华山蒟提取物杀菌效果最好.结论是5种植物提取物对猪两种致病菌呈现较好地体外抑杀效果,可能是因为其含有洋芹脑、吉马烯D、β-石竹烯、胡椒酮等活性抗菌成分所致.

植物提取物;气相色谱-质谱联机法;试管倍比稀释法

目前,在畜禽养殖中抗生素滥用的危害,如易产生耐药性、药物残留以及环境污染等日趋严重,开发抗菌效果好、安全低毒、无污染的植物提取物类饲料添加剂来取代或部分替代抗生素的使用迫在眉睫.华山蒟、山蒟、假蒟、毛脉树胡椒均属胡椒科(Piperaceae)植物,主要分布于我国热带和亚热带地区,资源丰富.已有研究报道,山蒟具有杀虫、抗血小板凝集和抗氧化作用[1-3];假蒟具有解热、抗炎、降血糖、抗氧化及有效抑制香蕉炭疽病、芒果炭疽病等多种植物病原菌作用[4-8],而关于毛脉树胡椒和华山蒟药理作用研究鲜有报道,但这几种植物同属于胡椒科属,且已有记载[9],胡椒科植物可入药治疗风寒感冒、呕吐腹泻、食欲不振等症.本试验旨在研究5种胡椒科植物提取物对猪金黄色葡萄球菌、猪大肠杆菌的体外抗菌效果,并采用气相色谱-质谱联用分析法,初步探讨其抗菌活性成分,为其作为饲料添加剂的应用开发提供依据.

1　材料与方法

1.1试验材料

1.1.1植物提取物制备将新鲜采集的5种植物样品(广西华山蒟、广西山蒟、毛脉树胡椒、海南假蒟、夏威夷假蒟,均采自中国热带农业科学院香料饮料研究所热带香料饮料种质圃),烘干,粉碎,用95%乙醇溶剂,75℃,热回流提取4 h,旋转蒸发定容至浓度为1 000 mg/mL(按烘干样原料算得),待用.

1.1.2菌种与培养基猪大肠杆菌(CVCC224)、猪金黄色葡萄球菌(CVCC546)标准菌株,均购自中国兽医微生物菌种保藏中心;营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、麦康凯培养基、Baird-parker琼脂基础培养基,均购自北京奥博星生物技术有限责任公司.

1.2试验方法

1.2.1GS-MS分析条件气相色谱DB-5MS毛细管色谱柱(30 mmX0.25 mmX0.25 μm);进样口温度150℃,传输线温度:280℃;柱温升温程序,60℃保持2 min,然后以5℃/min升温至280℃,保持10 min;载气为高纯氦气,柱流量1.0 mL/min;自动进样0.1 μL,分流比100∶1.

质谱条件:离子源温度,240℃;电离方式,EI,电子能量70 ev,其他参数为标准自动调谐参数;质量扫描范围,50～650 μm,溶剂延迟3 min;检索方式,仪器自动检索结合人工检索,依据为NIST标准质谱图库.

1.2.2菌悬液的制备及最低杀菌浓度(minimal bacteriocidal concentration,MBC)测定将2种菌株分别接种到已加有2 mL灭菌营养肉汤试管中进行纯培养活化,再分别配制成10X105CFU/mL试验菌液.

取68支灭菌试管,分为2组,每组34支,依次编号.用试管倍比稀释法,每支试管加入1 mL灭菌营养肉汤,再将1 mL 5种提取物溶液(1 g/mL)分别加入到每组第1支试管中,再从每组第1管吸取1 mL混合溶液至第2支试管,依次类推,直到第8管,从第8管中弃掉1 mL混合液.第9管为阳性对照,第10管为阴性对照.以上各管中分别加入1 mL 10X 105CFU/mL试验菌液,阴性对照加入1 mL灭菌营养肉汤.混匀,将上述试管37℃培养48 h,将含有猪大肠杆菌、猪金黄色葡萄球菌的试管培养物分别接种到麦康凯培养基、Baird-Parker琼脂基础培养基平板上,37℃培养24 h,观察有无细菌生长,以无菌生长平板对应的试管内提取物浓度为该菌株的最低杀菌浓度(MBC).

2　结果与分析

2.1气质成分分析结果5种植物提取物共分离鉴定出20多种化合物,按峰面积归一化法计算各成分的相对百分含量,结果见表1.

2.2对两种致病菌的杀菌效果由表2可知,5种植物提取物对猪大肠杆菌的最低杀菌浓度为广西华山蒟(31.25 mg/mL)<毛脉树胡椒=广西山蒟=海南假蒟=夏威夷假蒟(125 mg/mL);对猪金黄色葡萄球菌的最低杀菌浓度为广西华山蒟(7.80 mg/mL)<毛脉树胡椒(15.60 mg/mL)<广西山蒟=海南假蒟=夏威夷假蒟(62.50 mg/mL).

3　讨论与结论

经气质分析,从5种植物提取物中共鉴定出22个成分,洋芹脑(40.25%～49.42%)、吉马烯D (10.63%～13.28%)、β-石竹烯(8.23%～12.84%)、胡椒酮(4.35%～5.52%)、α-蒎烯(2.97%～3.86%)、4-萜烯醇(1.46%～2.00%)、天然维生素E(0.03%～0.36%)是它们的共有成分和主要成分.研究表明,洋芹脑具有抑菌消炎作用,其对副球孢子菌具有一定的抑制效果[10];胡椒酮具有平喘、止咳、祛痰、消炎作用,对慢性支气管炎的临床症状有较显著的改善作用[11];石竹烯具有局部麻醉作用和治疗结肠炎的作用[12].本试验中,5种提取物对猪两种致病菌均呈现较好地体外抑杀效果,可能与这些主要成分的药理作用有关,其中广西华山蒟的体外抑杀效果最好,其原因需待进一步研究.

表1　5种提取物化学成分分析结果

表2　不同浓度提取物的杀菌效果

王道平等[13]采用顶空固相微萃取法提取新鲜假蒟挥发油,并鉴定出48种化合物,其中主要化学成分为ɑ-月桂烯、ɑ-水芹烯、柠檬烯、芳樟醇,宋艳平等[14]采用水蒸气蒸馏法提取假蒟精油,并鉴定出60多种化合物,其中主要含有2,4,5-三甲氧基-1-丙烯基苯、顺-石竹烯、1,2-二甲氧基-4-(1-丙烯基)苯、细辛脑等,周亮等[15]研究山蒟醋酸乙酯提取物的化学成分,共分离得到N-p-香豆酰酪胺、马兜铃内酰胺、胡萝卜苷、藜芦酸等7种化合物.均与本试验结果存在较大差异.可能是因为提取方法、溶剂、条件和采集的时间、地点、生长环境等因素不同有关.

已有研究表明[16-19],丁香、八角茴香和迷迭香提取物、番石榴叶提取物、大蒜挥发油,以及葎草、蒲公英、马齿笕、紫花地丁提取物均具有较好抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等致病菌的活性,均与本试验结果一致.当今,充分利用现有植物资源,研究和开发安全有效、优良的饲料添加剂,减少或替代化学类抗生素药物的使用,提高畜产品质量是畜禽产业发展的重中之重.广西华山蒟、广西山蒟、毛脉树胡椒、海南假蒟、夏威夷假蒟作为我国南方植物资源,具有分布广泛、采收方便、价廉无毒等优点,本试验研究了其对猪两种致病菌的体外抗菌活性和初步分析了其主要成分,为今后研究确立其主要抗菌活性物质和作为饲料添加剂开发应用提供依据.

本试验中,5种植物提取物对猪两种致病菌均呈现较好地体外抑杀效果,可能是因为其含有洋芹脑、吉马烯D、β-石竹烯、胡椒酮等活性抗菌成分所致.

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Antibacterial study of fiveplant extracts against swinepathogens

WANG Ding-fa,ZHOU Lu-li,ZHOU Xiong,ZHOU Han-lin
(Tropical Crops Genetic Resources Institute,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Danzhou 571737,China)

The study was to do component analysis of five kinds of pepper plants ethanol extracts from Soxhlet extraction using gas chromatography-mass spectrometry method.The antibacterial effects in vitro of five extracts on swine E.coli and Staphylococcus aurous were studied.The results showed that apiole,germacrene D,β-caryophyllene,piperitone,α-pinene,4-terpene alcohol and natural vitamin E(0.03%～0.36%)were the common components and the main ingredients.The results indicated that five extracts all had good better antibacterial effect.The minimal bacteriocidal concentration(MBC)of ethanol extracts of Huashan pepper from Guangxi to swine E.coli and Staphylococcus aurous were 31.25 mg/mL and 7.8 mg/mL,respectively.Five kinds of pepper plants eth⁃anol extracts showed good inhibitory effect to two swine pathogens,probably because its ethanol extract contains apiole,germacrene D,β-caryophyllene,piperitone and other active antibacterial ingredients.

plants extracts;gas chromatography-mass spectrometry method;tube dilution method

ZHOU Han-lin

R 285

A

0529-6005(2016)06-0060-03

2015-04-07

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(1630032015042,16300320150046)

王定发(1979-),男,助理研究员,博士,研究方向为动物营养与饲料科学,E-mail:wangdingfa197945@aliyun.com

周汉林,E-mail:zhouhanlin8@163.com