高媛媛,陈　颖,钟留情,任美美,许清慧,张世佳,范云鹏,麻武仁,宋晓平

(西北农林科技大学动物医学院中兽医药研究所,陕西杨凌712100)

中药复方子宫灌注液中盐酸小檗碱和丹酚酸B的质量控制

高媛媛,陈颖,钟留情,任美美,许清慧,张世佳,范云鹏,麻武仁,宋晓平

(西北农林科技大学动物医学院中兽医药研究所,陕西杨凌712100)

为了建立中药复方子宫灌注液的质量标准,采用薄层色谱法(TLC)对其中的黄连和丹参进行定性鉴别,并采用高效液相色谱(HPLC)法测定黄连中盐酸小檗碱和丹参中丹酚酸B的含量.结果:薄层色谱斑点清晰,阴性对照无干扰;盐酸小檗碱含量测定的线性方程为Y=38553X-89683(r=0.9998),进样量在4.1616～83.232 μg/mL浓度范围内具有良好线性关系,平均回收率为98.59%,RSD为0.70%;丹酚酸B含量测定的线性方程为Y=1X107X-80303(r=0.9999),进样量在0.02952～1.476 mg/mL浓度范围内具有良好线性关系,平均回收率为98.60%,RSD为1.86%;结论:该方法简便易行,专属性强,重复性好,可用于该制剂的质量控制.

中药子宫灌注液;盐酸小檗碱;丹酚酸B;质量控制

奶牛子宫内膜炎是奶牛养殖业中普遍存在的一种繁殖障碍性疾病,严重危害奶牛业的发展.奶牛子宫内膜炎主要用抗菌药物和激素治疗,这些药物的长期使用,不仅容易导致病原耐药性,而且易在牛奶中残留,严重威胁人类健康.中药具有资源丰富、毒副作用小、不产生耐药性和残留少的优点,在子宫内膜炎治疗方面具有潜在应用前景.中药复方子宫灌注液由黄连、连翘、丹参和红花经水煎而成,具有清热燥湿和活血化瘀之功效[1],临床上治疗奶牛急性子宫内膜炎效果显著[2].本试验采用薄层色谱法对其中的黄连和丹参进行鉴别,采用高效液相色谱法测定盐酸小檗碱和丹酚酸B的含量,旨在为该中药复方子宫灌注液的质量控制及进一步应用提供科学依据.

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试药与试剂黄连对照药材(批号:120913-201310),盐酸小檗碱对照品(含量86.7%,批号:110713-201212),丹酚酸B对照品(含量97%,批号:111562-201212),均购自中国食品药品检定研究院.黄连、丹参药材,均购自西安市万寿路药材批发市场.中药复方子宫灌注液为本实验室自制.乙腈(色谱纯,批号:1210042),甲醇(色谱纯,批号: 1210058),美国;其他试剂均为分析纯.

1.1.2主要仪器Waters高效液相色谱系统,美国Waters公司.

1.2方法

1.2.1中药复方灌注液中黄连和丹参的鉴别

(1)黄连及对照溶液的制备:取3个批次的中药灌注液各2 mL,加无水甲醇5 mL,混匀,滤过,取滤液作为样品溶液[3],并制备不含黄连的灌注液阴性样品溶液;取黄连药材粉末0.25 g,加甲醇25 mL,超声处理30 min,滤过,取滤液作为黄连药材溶液;取黄连对照药材0.25 g,同法制成对照药材溶液,另取盐酸小檗碱对照品,加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液,作为对照品溶液;(2)丹参及其对照溶液的制备:取3个批次的中药灌注液各10 mL,加10 mL水、1 mL稀盐酸,摇匀,过滤,滤液中加入20 mL乙酸乙酯,振摇提取,分取乙酸乙酯层,蒸干,残渣中加入4 mL甲醇使溶解,作为样品溶液[9],并制备不含丹参的灌注液阴性样品溶液;取丹参药材粉末0.2 g,加75%甲醇25 mL,加热回流1 h,滤过,滤液浓缩至1 mL,作为丹参药材溶液,另取丹酚酸B对照品,加75%甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液,作为对照品溶液;(3)黄连的薄层色谱检测:分别吸取盐酸小檗碱对照品溶液、黄连对照药材溶液、黄连药材溶液、样品溶液、阴性样品溶液各1 μL,分别点于同一高效硅胶G薄层板上,以环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1)为展开剂,置于浓氨试液预饱和20 min的展开缸内,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365 nm)下检视[4];(4)丹参的薄层色谱鉴别:分别吸取丹酚酸B对照品溶液、样品溶液、阴性样品溶液各1 μL,丹参药材溶液0.5 μL,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶6∶1)为展开剂中,展开,取出,晾干,置紫外光灯(254 nm)下检视[5].

1.2.2中药复方灌注液中盐酸小檗碱和丹酚酸B的含量测定(1)色谱条件:色谱柱均为Diamon⁃sil C18(5 μm,150X4.6 nm),流速为1 mL/min,柱温为30℃,进样量为10 μL.盐酸小檗碱以乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(50∶50)(每100 mL中加十二烷基硫酸钠0.4 g,再以磷酸调节pH值4.0)为流动相,检测波长为345 nm;丹酚酸B以甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59)为流动相,检测波长为286 nm;(2)对照品溶液的制备:精密称取盐酸小檗碱对照品0.0060 g,加甲醇制成每1 mL含208.08 μg的溶液;或精密称取丹酚酸B对照品0.0274 g,加75%甲醇制成每1 mL含1.476 mg的溶液;(3)样品溶液的制备:取中药灌注液2 mL于具塞锥形瓶中,精密加入甲醇-盐酸(100∶1)的混合溶液50 mL,密塞,称重,超声处理30 min,放冷,再称重,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液5 mL于10 mL量瓶中,甲醇定容,摇匀,滤过,取续滤液,即得盐酸小檗碱样品溶液[8].另取中药灌注液2 mL于具塞锥形瓶中,精密加入75%甲醇50 mL,称重,加热回流1 h,放冷,再称重,用75%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得丹酚酸B样品溶液[8];(4)阴性样品溶液的制备:按处方比例分别称取不含黄连或不含丹参的其他药材,依照中药灌注液的生产工艺制成阴性灌注液,再分别按样品溶液的制备方法制成各自的阴性样品溶液;(5)专属性试验:在上述色谱条件下,分别取对照品溶液、阴性样品溶液和样品溶液各10 μL,注入液相色谱仪,记录色谱图;(6)线性关系考察:分别取盐酸小檗碱对照品溶液(浓度208.08 μg/mL)0.1,0.2,0.4,0.8,1.6,2 mL于5 mL量瓶中,甲醇定容.另取丹酚酸B对照品溶液(浓度1.476 mg/mL),分别将其稀释50,25,10,4,2倍和原液.分别精密吸取10 μL注入高效液相色谱仪,分别记录峰面积.以进样浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,进行线性回归;(7)精密度试验:分别吸取33.29 μg/mL的盐酸小檗碱对照品溶液或0.369 mg/mL的丹酚酸B对照品溶液各10 μL,连续进样6次,分别测定峰面积;(8)稳定性试验:吸取同一样品溶液10 μL,分别在0、2、4、6、10、24 h测定盐酸小檗碱或丹酚酸B峰面积;(9)重复性试验:取同一批样品,分别制备6份样品溶液,吸取10 μL,测定盐酸小檗碱或丹酚酸B峰面积;(10)加样回收试验:精密量取已知含量的样品(盐酸小檗碱含量497.44 μg/mL) 1 mL,加入盐酸小檗碱对照品溶液(208.08 μg/ mL)2.4 mL;或精密量取已知含量的样品(丹酚酸B含量2.8552 mg/mL)1 mL,加入丹酚酸B对照品溶液(1.476 mg/mL)1.9 mL,分别按样品溶液制备方法制备成溶液后,分别依照上法测定,计算平均回收率;(11)样品含量测定:取3批样品,每批取3份,分别按样品溶液的制备方法制备,精密吸取样品溶液10 μL,按前述色谱条件测定其中盐酸小檗碱或丹酚酸B的含量.

2　结果

2.1中药复方灌注液中黄连和丹参的鉴别在紫外灯下,黄连样品溶液色谱中,在与黄连对照药材色谱相应的位置上,显4个以上相同颜色的荧光斑点;在与盐酸小檗碱对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,而阴性样品溶液在此位置上没有斑点(图1).丹参样品溶液和丹酚酸B对照品溶液在薄层板相应的位置上显现相同颜色的荧光斑点,而阴性样品溶液没有显示此斑点(图2).

2.2中药复方灌注液中盐酸小檗碱和丹酚酸B的含量测定

2.2.1专属性试验样品溶液色谱峰中盐酸小檗碱或丹酚酸B与杂质分离完全,分离度均大于1.5,中药灌注液中其他成分对盐酸小檗碱或丹酚酸B的测定无干扰(图3,图4).

2.2.2线性关系考察盐酸小檗碱和丹酚酸B含量测定的线性方程分别为Y=38553X-89683(r= 0.9998)和Y=1X107X-80303(r=0.9999),进样量分别在4.1616～83.232 μg/mL和0.02952～1.476 mg/ mL浓度范围内,与峰面积具有良好线性关系.

图1　黄连的薄层色谱鉴别

图2　丹参的薄层色谱鉴别

图3　盐酸小檗碱的高效液相色谱

图4　丹酚酸B的高效液相色谱

2.2.3精密度、稳定性、重复性试验盐酸小檗碱峰面积RSD分别为0.55%,0.26%,0.94%(n=6),丹酚酸B峰面积RSD分别为0.27%,0.48%,1.35%(n=6),表明仪器精密度良好,样品溶液在24 h内稳定,重复性良好.

2.2.4加样回收率试验盐酸小檗碱和丹酚酸B的平均回收率分别为98.58%和98.60%,RSD分别为0.70%和1.86%(n=6),说明准确度较好.

2.2.5样品含量测定3批样品中盐酸小檗碱的平均含量分别为497.61,497.16,498.70 μg/mL,RSD分别为0.30%,0.26%,0.43%;丹酚酸B的平均含量分别为2.8408,2.8581,2.8498 mg/mL,RSD分别为0.60%,0.45%,0.61%,说明所建立的方法可用于制剂的质量控制.

3　讨论

3.1关于中药复方子宫灌注液中黄连和丹参的鉴别在进行中药复方制剂的质量控制时,主要药物成分的薄层色谱鉴别是常用的方法.本试验参照王丹[3]报道的黄连液样品的前处理方法,即在中药复方灌注液中加入甲醇,取滤液,再采用2010年版兽药典中黄连药材的薄层色谱鉴别方法进行检测[4],结果表明,中药复方灌注液样品中出现盐酸小檗碱的特征性斑点,且与其他成分的分离效果良好.在进行丹参鉴别时,参照王雪彦等[5]报道的方法,对中药复方灌注液中的丹酚酸B进行了提取和富集,并采用2010版兽药典中丹参药材丹酚酸B薄层色谱鉴别用展开剂,但分离效果欠佳,遂改用甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶6∶1)为展开剂[5],中药复方灌注液样品中的丹酚酸B与其他成分的分离效果好,紫外灯下检视,在与丹酚酸B对照品相同的位置处斑点清晰可见,且阴性样品溶液无干扰.

3.2关于中药复方子宫灌注液中盐酸小檗碱和丹酚酸B的含量测定本试验参照2010年版兽药典中的黄连和丹参质控成分含量测定方法,对中药复方灌注液中盐酸小檗碱和丹酚酸B的含量进行了测定,结果表明,本方法专属性强,重现性好,稳定准确,可用于该中药复方灌注液中盐酸小檗碱和丹酚酸B的含量测定.

[1]智晓艳,崔恩慧,范云鹏,等.14种中药及其复方的体外抗菌活性[J].西北农业学报,2014,23(7):114-119.

[2]冯伟,张烜明,麻武仁,等.中药复方灌注液对奶牛急性子宫内膜炎临床疗效观察[J].动物医学进展,2015,36(1):131-134.

[3]王丹.黄连液质量标准的研究[J].湖北中医杂志,2013,35 (2):73-74.

[4]中国兽药典委员会.中国兽药典(二部)[S].北京:中国农业出版社,2010.

[5]王雪彦,陈泽莲,宋毅.参苓胃炎合剂中丹参的薄层鉴别[J].华西药学杂志,2013,28(6):643-644.

Quality Control of BerberineHydrochlorideand Salvianolic Acid B in Traditional ChineseMedicineCompound UterinePerfusate

GAO Yuan-yuan,CHEN Ying,ZHONG Liu-qing,REN Mei-mei,XU Qing-hui,ZHANG Shi-jia,FAN Yun-peng,MA Wu-ren,SONG Xiao-ping
(Institute of Traditional Chinese Veterinary Medicine,College of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Yangling 712100,China)

To establish the quality standard for traditional Chinese medicine compound uterine perfusate.TLC method was performed to identify Coptidis rhizoma and Salvia miltiorrhiza radix et rhizoma in traditional Chinese medicine compound uterine perfusate,and HPLC was used to determine the content of berberine hydrochloride and salvianolic acid B.The spots of TLC were distinguished and clear and the negative control had no interference.The regression equation for determining berberine hydrochloride was Y=38553X-89683 (r=0.9998),and showed a good liner relationship within the range of 4.1616-83.232 μg/mL.The average recovery rate was 98.59% with RSD of 0.70%.The regression equation for determining salvianolic acid B was Y=1X107X-80303(r=0.9999),and showed a good liner relationship within the range of 0.02952-1.476 mg/mL.The average recovery rate was 98.60%with RSD of 1.86%.The methods are simple and convenient with strong specificity and good repeatability,which could be used for the quality control of this preparation.

Traditional Chinese medicine compound uterine perfusate;Berberine hydrochloride;Salvianolic acid B;Quality control

SONG Xiao-ping

S853.72

A

0529-6005(2016)06-0054-03

2015-04-16

公益性行业(农业)科研专项(201303040);西北农林科技大学大学生创新性实验计划项目

高媛媛(1989-),女,硕士,从事中兽药研发工作,E-mial:gaoyuanyuan312@126.com

宋晓平,E-mial:sxpxbnl@163.com