徐长赓,周永辉,杨艳北,郝美琪,陈俭清,李艳华

(东北农业大学动物医学学院,黑龙江哈尔滨150030)

阿司匹林对木糖葡萄球菌体外生物被膜的作用

徐长赓,周永辉,杨艳北,郝美琪,陈俭清,李艳华

(东北农业大学动物医学学院,黑龙江哈尔滨150030)

通过阿司匹林对木糖葡萄球菌生物被膜干预作用的研究,为木糖葡萄球菌生物被膜的治疗提供理论参考.通过结晶紫染色法(CV)、XTT分析法和激光共聚焦显微镜方法研究阿司匹林对木糖葡萄球菌生物被膜的作用及生物被膜下活菌和死菌的分布情况.结果显示,阿司匹林对木糖葡萄球菌有抑菌作用并且对其生物被膜的干预作用显著.

阿司匹林;木糖葡萄球菌生物被膜;结晶紫染色法;激光共聚焦显微镜;XTT分析法

奶牛乳房炎不仅是奶业危害十分严重的疾病之一,而且是导致奶牛淘汰的第三大疾病.近几年,血浆凝固酶阴性葡萄球菌被认为是导致奶牛乳房炎的病原菌,木糖葡萄球菌(Staphylococ⁃cus xylose)是一种血浆凝固酶阴性葡萄球菌(CNS).此菌广泛分布于自然界,虽然以往认为是非致病菌[1],但是木糖葡萄球菌能够形成生物被膜(BF)[2],是引起奶牛乳房炎不易治愈和反复发作的重要原因之一.

生物被膜是细菌产生的多聚复合物基质将自身包绕,粘附于无活性物体或活体表面,形成的有一定结构的细菌群体;生物被膜内细菌可以抵抗宿主免疫力,同时对抗生素产生广泛的耐药性,造成感染难以治愈,反复发作[3].目前国外有研究结果表明,阿司匹林能干预白色念珠菌生物被膜形成,可以有效抑制生物被膜的生长和成熟,且具有浓度依赖性[4].但是阿司匹林对木糖葡萄球菌生物被膜是否具有干预作用国内外尚未见报道,故研究拟通过在体外建立木糖葡萄球菌生物被膜模型,观察阿司匹林对木糖葡萄球菌生物被膜的作用,为其治疗木糖葡萄球菌生物被膜相关感染提供科学依据.

1　材料与方法

1.1菌株及试剂木糖葡萄球菌ATCC700404,ATCC29971,ATCC35924,购自美国模式培养物集存库;阿司匹林(Sigma公司);甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司);TSB(青岛高科园海博生物技术有限公司);XTT试剂盒(凯基生物科技发展有限公司);Live/dead试剂盒(Molecular Probes);酶标仪(美国Epoch公司);激光共聚焦显微镜(莱卡Leica公司).

1.2菌种的复苏、传代将木糖葡萄球菌ATCC700404,ATCC29971,ATCC35924复苏后接种到TSB培养基中,放入37℃恒温培养箱中培养12 h.以相同接种方法对木糖葡萄球菌进行传代纯化培养后,即可备用.

1.3药物的配制精密称取阿司匹林1.00 g,溶于10 mL甲醇中,配成浓度为100 mg/mL的药物.作为储备液.取1 mL储备液过0.22 μm的有机相滤膜,用甲醇溶液稀释后供测量MIC使用.

1.4阿司匹林对木糖葡萄球菌最小抑菌浓度的测定(MIC)试验操作及结果按照美国临床实验室国家标准委员会(NCCLS)推荐的标准微量稀释法进行判定[5].

1.5亚抑菌浓度下对木糖葡萄菌生物被膜的干预作用向96孔板中加入菌液和各个浓度药物共200 μL(药物终浓度分别为1/2MIC,1/4MIC,1/ 8MIC,1/16MIC).另设空白对照孔(只含有培养基)、甲醇对照孔(加入与药物等量体积的甲醇)和阴性对照孔(未加药物的生物被膜生长对照).每个浓度3组平行.于37℃恒温培养箱中培养24 h.固定,结晶紫染色,用酶标仪在570 nm处,测定吸光度.

1.6亚抑菌浓度对木糖葡萄菌生物被膜下细菌活性的测定XTT工作液按照试剂盒的说明书配制.将培养好的96孔细胞培养板取出,弃掉菌液,灭菌PBS冲洗2次,每孔分别加入100 μL新TSB培养基和20 μL XTT工作液,放入37℃恒温孵箱中培养3 h后用多功能酶标仪测定每孔在450 nm处的吸光值.试验重复3次.细菌存活率计算

1.7live/dead染色法测定木糖葡萄菌生物被膜下死菌和活菌的分布情况从6孔板中取出已形成生物被膜的盖玻片,用灭菌PBS轻轻漂洗,除去BF表面的游离细菌.在每张玻片BF表面滴加配制好的荧光染液(SYT09/PI),避光孵育15 min,再用灭菌生理盐水漂洗掉未结合的荧光探针,再将已形成生物被膜的盖玻片盖在滴有组分C的载玻片上,置CLSM观察.分别采用绿色通道接收绿色信号,红色通道接收红色信号[6].

1.8数据分析本试验采用SPSS 20.0软件对数据进行统计学处理与分析,数据以(-X±SD)表示,采用多重比较和单因素方差分析对各组数据进行分析和比较.(P<0.05为差异性显著,P<0.01为差异性极显著).

2　结果

2.1阿司匹林对木糖葡萄球菌MIC的结果通过试验可以得出,阿司匹林对木糖葡萄球菌ATCC700404的MIC为0.625 mg/mL.阿司匹林对木糖葡萄球菌ATCC29971的MIC为1.25 mg/mL.阿司匹林对木糖葡萄球菌ATCC35924的MIC为1.25 mg/ mL.

2.2不同药物浓度下干预生物被膜形成能力的检测通过结晶紫染色,在酶标仪570 nm处,测定各个药物浓度的OD值,结果见图1.OD值随着药物浓度的增大而减小,呈现负相关.经过SPSS软件分析,每个浓度的OD值与阴性对照存在显著性差异(P<0.05).甲醇对照组和菌液对照组的OD值之间,没有显著性差异(P>0.05),说明阿司匹林对3株木糖葡萄球菌的生物被膜均有干预作用.

2.3不同药物浓度下对生物被膜内细菌活性的分析通过XTT染色法测定木糖葡萄球菌生物被膜下细菌的活性,由图2可见,随着药物浓度的减小,A值不断增大,活菌数增多,细菌存活率不断上升.与结晶紫染色得到的结果相吻合,这表明阿司匹林可以抑制生物被膜内细菌.

图1　阿司匹林对木糖葡萄球菌生物被膜的干预作用

2.4live/dead染色法观察生物被膜下活菌和死菌分布情况通过live/dead染色法测定木糖葡萄菌生物被膜下死菌和活菌的分布情况,结果见图3.图3(a)显示,在未加药的情况下,横截面红绿通道信号的叠加图,其中,红色荧光代表死菌(死菌被PI着色发出红色荧光),绿色荧光代表活菌(活菌被SYTO9着色发出绿色荧光),部分图像呈橙色或桔黄色,一般认为是死菌和活菌重叠造成.可观察到细菌密集,层叠如集云状,绿色荧光占据视野,几乎看不到红色荧光.图3(b)显示,当阿司匹林浓度为1/2MIC时,红绿通道信号的叠加图.横截面图中明显可见死菌(红色荧光).细菌之间有许多不能被SYTO9/PI着色的黑色区域,呈管道或泡状,但认为BF结构已经形成.

图2　木糖葡萄球菌生物被膜下的细菌存活率

图3　木糖葡萄球菌激光共聚焦图

3　讨论

木糖葡萄球菌是一种血浆凝固酶阴性葡萄球菌,因其感染奶牛乳房后的难治愈性及反复发作性,给奶牛养殖户造成了重大的经济损失,其生物被膜的形成是奶牛隐性乳房炎难治愈和反复发作的主要原因[7].生物被膜的形成包括初始粘附阶段、表面微菌落的形成、分化成熟3个过程.生物被膜一旦形成,膜内细菌比浮游细菌耐药性增加100～1 000倍以上.生物被膜阻止和抑制巨噬细胞、白细胞、抗体及抗生素侵入生物被膜中杀灭细菌,导致感染反复发生,难以控制[8].抑制细菌生物被膜产生,同时抑制细菌生物被膜的形成亦是现阶段新型抗菌药物研发的重要方向.

有文献已经报道阿司匹林对细菌的生物被膜有干预作用,并且呈现剂量依赖性[9].但是,目前尚未有阿司匹林对木糖葡萄球菌生物被膜干预的相关报道.阿司匹林作为最古老最常用的非甾类抗炎药物,除解热、镇痛、抗炎、抗凝等作用外,最近研究显示其还具有抗真菌和抗细菌等药理作用[10].由于它克服了抗生素毒副作用较大、易使微生物产生耐药性的弊端又具有抗菌性、使用安全等优点,所以在临床上应用日趋广泛.本试验采用亚MIC浓度的阿司匹林对木糖葡萄球菌生物被膜进行干预,应用结晶紫染色方法显示,阿司匹林在亚MIC浓度下对木糖葡萄球菌生物被膜有明显的干预作用.生物被膜总量随着药物浓度的增加不断减少.但结晶紫染色法是对生物被膜总量进行测定,无法反映生物被膜内细菌的活力情况.所以XTT可以在不破坏生物被膜完整结构的情况下进行生物被膜中细菌活性的研究,结合激光共聚焦显微镜的图片可以更加直观的观察到生物被膜下细菌的活性分布[11].用药后,生物被膜下的活菌数明显减少.1/2MIC药物浓度时效果显著.所以,通过XTT分析法和激光共聚焦显微镜联合观察生物被膜下细菌活性也表明阿司匹林在亚MIC浓度对木糖葡萄球菌生物被膜有明显的干预作用.

生物被膜的形成亦受很多基因的调控.Yan⁃nick D等人[12]研究表明,木糖葡萄球菌中存在大量bap基因,并且基于bap基因的广泛分布,木糖葡萄球菌生物被膜的形成依赖于bap基因的表达.我们在后续的试验中将探讨阿司匹林是否可能通过抑制bap基因的表达来干预木糖葡萄球菌生物被膜形成.

[1]干霞芳,李蒙英.生物膜和生物膜形成菌的研究[J].安徽大学学报(自然科版),2007(06):58.

[2]马晓艳,姚刚,黄燕,等.新疆某地奶牛隐性乳房炎病原分离鉴定及药敏试验[J].新疆农业大学学报,2007(01):33.

[3]Grenier D,Grignon L,Gottschalk M.Characterisation of biofilm formation by a Streptococcus suis meningitis isolate[J].The Veteri⁃nary Journal,2009,179(2):292-295.

[4]Alem M A,Douglas L J.Effects of aspirin and other nonsteroidal anti-inflammatory on biofllms and planktonic cells of Candida al⁃bicans[J].Antimicrob Agents Chemother,2004;48:41-47.

[5]Stepanovic S,Vukovic D,Dakic I,et al.A modified microtiterplate test for quantification of staphylococcal biofilm formation[J]. J Microbiol Methods,2000,40(2):175-179.

[6]郜向娜,余加林,芦起,等.四唑盐减低法结合激光共聚焦显微镜定量分析表皮葡萄球菌生物被膜体外模型[J].中国微生态学杂志,2010(12):35.

[7]任晓镤.新疆南疆地区奶牛乳房炎性表皮葡萄球菌生物被膜形成及其影响因素的研究[D].阿拉尔:塔里木大学,2012.

[8]屈常林,高洪,赵宝洪,等.细菌生物被膜与抗生素耐药机制研究进展[J].动物医学进展,2008,29(3):86-90.

[9]Toumu H,Van Dijck P.Candida biofilms and the host:models andnew concepts for eradication[J].Int J Microbiol,2012;2012: 845352.

[10]Trofa D,Agovino M,Stehr F,et al.Acetylsalicylic acid(aspirin) reduces damage to reconstituted human tissues infected with Candida species by inhibiting extracellNlar fungal lipases[J].Microbes Infect,2009,11:1131-1139.

[11]Ndebele K,Gona P,Jin T G,et al.Tum or necrosis factor(TNF) related apoptos inducing ligand(TRAIL)induced mitochond rial pathway to apoptosis and caspase activat ion is potentiated by phospholipid scramblase-3[J].Apop tos is,2008,13(7):845-850.

[12]Yannick D N.Tremblay,Daphnée Lamarche,Panline Chever,et al.Characterization of the ability of coagulase-negative staphylo⁃cocci isolated from the milk of Canadian farms to form biofilms [J].JDairy Sci,2013,96:240-243.

Effect of aspirin againstStaphylococcus xylosusbiofilmin vitro

XU Chang-geng,ZHOU Yong-hui,YANG Yan-bei,HAO Mei-qi,CHEN Jian-qing,LI Yan-hua
(College of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Aspirin against Staphylococcus xylose biofilm showed that it could be provide a new therapeutic approach for the in⁃fection caused by biofilm.The effect of aspirin against Staphylococcus xylose biofilm was assessed by the crystal violet staining (CV).The bacteria activity under the mature biofilm was used to measure by XTT and CLSM.The results indicated that aspirin in⁃hibited the growth of bacterial and had a significant impact on Staphylococcus xylose biofilm(P<0.05).Our data show that,the as⁃pirin on Staphylococcus xylosus biofilm has a significant intervention effect.

Aspirin;StaphylococcusxyloseBiofilm;crystalvioletstaining(CV);Confocallaserscanningmicroscopy(CLSM); XTT

LI Yan-hua

R 96

A

0529-6005(2016)06-0033-03

2015-07-14

国家自然科学基金(GA15B201)

徐长赓(1992-),男,硕士生,研究方向为兽医药理学,E-mail:616167294@qq.com

李艳华,E-mail:liyanhua1970@163.com