王晨曦,张谞霄,孙洪磊,蒲　娟

(中国农业大学动物医学院,北京海淀100193)

北美H7亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法的建立

王晨曦,张谞霄,孙洪磊,蒲娟

(中国农业大学动物医学院,北京海淀100193)

本研究通过分析NCBI数据库中H7亚型禽流感病毒HA基因序列,根据该基因设计引物,建立了针对北美H7亚型禽流感病毒HA基因的一步法RT-PCR检测方法,并对反应条件进行了优化.该方法可特异地检出北美H7亚型禽流感病毒HA基因,而未检出欧亚分支H7亚型禽流感病毒H7N2和H7N9、其他亚型流感病毒(H1N1、H3N2、H5N1、H5N8和H9N2),以及新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒;检测方法的灵敏度可达0.1 pg/μL.该检测方法的建立为监测北美H7亚型禽流感病毒提供了良好的技术支撑,可用于外来禽流感病毒的检测.

H7亚型禽流感病毒;北美分支;HA;RT-PCR

禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)属于正黏病毒科流感病毒属,是一种呈球形或杆状、有包膜的单股负链RNA病毒,其基因组由8个节段组成.依据病毒表面的血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)蛋白抗原性的不同,甲型流感病毒可分为18个HA亚型(H1～H18)和11个NA亚型(N1～N11)[1].根据病毒对鸡的致病性,可分为低致病性禽流感(low pathogenic avian influenza,LPAI)病毒和高致病性禽流感(high pathogenic avian influenza,HPAI)病毒,其中HPAI由H5或H7亚型病毒引起.与其他禽流感病毒相似,根据HA基因的分子遗传进化特点,H7亚型禽流感病毒可以分为两个进化分支:欧亚分支和北美分支[2].

自1963年英国火鸡发生H7N3亚型HPAI以来,先后有H7N3、H7N7、H7N4、H7N1、H7N2多种亚型流感病毒在鸡、火鸡、鸭、鹌鹑等多个品种的家禽中发生[3].除了亚型组合方式多样化、感染宿主种类多之外,H7亚型禽流感病毒的地理分布也非常广泛,欧洲、加拿大、美国等欧美国家是H7亚型禽流感病毒的高发地区[4].近年来,H7亚型流感病毒,特别是新型H7N9流感病毒感染人的报道引发了人们的广泛关注[5].研究表明,北美分支的H7亚型禽流感病毒相比于欧亚分支的H7亚型禽流感病毒获得了更强的α-2,6唾液酸糖苷结合能力[6],而α-2,6唾液酸糖苷正是人类上呼吸道主要分布的流感病毒受体[7],这可能增强该类病毒跨物种感染.动物试验也证实部分北美分支H7亚型禽流感病毒能够在雪貂间接触传播[8].因此,北美分支H7亚型禽流感病毒的公共卫生学意义更值得关注.

目前为止,我国尚未有人或禽类感染北美H7亚型流感病毒的报道,但是禽产品贸易交流以及候鸟迁徙都可能将北美源H7亚型禽流感病毒传入我国.因此建立一种针对北美H7亚型流感病毒的检测方法并开展监测十分重要.本研究我们建立了针对北美H7亚型禽流感病毒HA基因的RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性和敏感性进行了优化和评价,该方法的建立对监测北美源H7亚型禽流感病毒入境传播具有重要意义.

1　材料与方法

1.1质粒北美H7亚型流感病毒A/New York/ 107/2003(H7N2)和A/mallard/Ohio/11OS2010/2011 (H7N8)HA基因质粒由上海生工生物工程技术服务有限公司合成.

1.2病毒A/California/04/2009(H1N1)、A/duck/ Anhui/D293/2014(H3N2)、A/chicken/Shandong/16/05 (H9N2)、新城疫病毒LaSota和鸡传染性支气管炎病毒H120等由本实验室分离和/或保存.H5N1禽流感病毒、欧亚分支H7N2病毒和H7N9病毒等的诊断抗原,购自哈尔滨维科生物制品有限公司.

1.3试剂TRIZol,购自Invitrogen公司;Taq Mix、Trans DNA Marker I,购自北京全式金生物技术有限公司;反转录流感特异性引物为Uni 12:5′-AG⁃CAAAAGCAGG-3′,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成;反转录试剂盒Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit,购自Thermo公司.

1.4引物设计与合成参照GenBank已发布的H7亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因序列,利用MEGA4.1和Primer Premier 5.0针对北美源H7亚型禽流感病毒保守区域设计引物.引物序列分别为,F:5′-CAAACAGAAAAGCCTCCTTCTGGCT-3′; R:5′-GTCTTTGTACCCACTACTCAACTTC-3′;扩增片段大小约590 bp.引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成.

1.5总RNA提取及反转录TRIZol法分别提取H1N1、H3N2、H5N1、H5N8、H7N2、H7N9和H9N2亚型流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的总RNA.按照试剂盒说明书进行反转录获得cDNA,用于PCR扩增.

1.6PCR扩增PCR反应体系如下:2XMix Buffer 12.5 μL;Primer-F 0.5 μL;Primer-R 0.5 μL;cDNA 2 μL;加双蒸水至终体积为25 μL,混匀.PCR反应程序为:94℃5 min;94℃30 s;58℃30 s; 72℃1 min;72℃10 min;4℃保存.从第二步至第四步反应进行29个循环.反应结束后,取3 μL产物于2%琼脂糖凝胶进行电泳检测.

1.7反应条件的优化(1)退火温度的优化:分别以50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60℃为退火温度进行PCR反应,以确定最佳的退火温度;(2)延伸时间的优化:分别以30、40、50、60 s为延伸时间进行PCR反应,以确定最佳的延伸时间;(3)优化循环次数:分别以26、27、28、29、30为循环次数进行PCR反应,以确定最佳的循环次数.

1.8特异性试验用建立的RT-PCR方法分别对北美H7N2禽流感病毒HA质粒、H7N8禽流感病毒HA质粒,及欧亚分支H1N1、H3N2、H5N1、H5N8、H7N2、H7N9和H9N2流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒进行检测,并设置阴性对照,以评价该方法的特异性.

1.9敏感性试验将北美H7亚型禽流感病毒A/ New York/107/2003(H7N2)HA质粒稀释至10 ng/ μL,再依次进行10倍倍比稀释,作为模板进行RT-PCR扩增,评价该方法的敏感性.

2　结果与分析

2.1RT-PCR检测方法的建立

2.1.1退火温度的优化分别以50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60℃的退火温度进行PCR反应,结果表明,最佳退火温度为58℃,此时条带清晰明亮,无拖带或引物二聚体.

2.1.2延伸时间的优化分别以30、40、50、60 s为延伸时间进行PCR反应,结果表明,最佳延伸时间为60 s,此时条带最亮.

2.1.3循环次数的优化分别以26、27、28、29、30 s的循环次数进行PCR反应,从减少检测时间方面考虑,循环数越少越好,结果表明,最佳循环次数为29.

2.2特异性评价用建立的RT-PCR方法分别对北美H7N2亚型和H7N8亚型禽流感病毒HA质粒,及欧亚分支H1N1、H3N2、H5N1、H5N8、H7N2、H7N9和H9N2亚型流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒进行检测,以评价该方法的特异性.结果表明,针对北美H7N2禽流感和H7N8禽流感病毒HA质粒的扩增出现预期大小的PCR扩增条带,其他毒株均未见扩增条带.

2.3敏感性评价将北美H7亚型禽流感病毒A/ New York/107/2003(H7N2)HA质粒稀释至10 ng/μL,再依次进行10倍倍比稀释,作为模板进行RT-PCR扩增,评价该方法的敏感性.结果显示,该引物能检测出的最低质粒浓度为0.1 pg/μL.

图1　北美H7亚型禽流感病毒HA基因RT-PCR检测方法的特异性评价

图2　北美H7亚型禽流感病毒HA基因RT-PCR检测方法的敏感性评价

3　讨论

欧洲、澳大利亚、加拿大、美国等欧美的国家是H7亚型禽流感疫情的高发地区.近年来,巴基斯坦、朝鲜、韩国、日本等多个亚洲地区国家也开始频繁出现H7亚型禽流感疫情[9-11].2013年暴发H7N9禽流感疫情之前,我国只在2002年河北省一蛋鸡场分离到一株低致病性H7N2亚型禽流感病毒(A/Chicken/ Hebei/1/2002)[12].但随着国际贸易的增加以及候鸟迁徙带毒的影响,北美源H7亚型禽流感病毒传染我国的风险日益增加,因此急需建立一种针对北美H7亚型禽流感病毒的快速检测方法.

传统的流感病毒检测方法为将病料处理后,采用鸡胚接种方式进行病毒分离,然后采用血凝抑制试验对流感病毒亚型进行鉴定.但是这种传统的检测方法耗时较长,不能在短时间内确诊.目前常用的检测方法还有琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光技术等,但都存在费时、费力、繁琐、花费大、灵敏度不高等不足[13].上述方法不适用于外来疫病的检测.

聚合酶链式反应(PCR)是近年发展成熟的一种基因体外复制扩增技术,能使微量DNA在数小时内呈指数增加,具有特异性强、灵敏度高、简便快捷等优点[14].因此,可以利用目的基因质粒建立检测方法,适用于外来疫病的监测.本研究通过比对NCBI数据库中的H7亚型禽流感病毒HA基因序列,建立了针对北美H7亚型禽流感HA基因的RT-PCR检测方法.该方法能够特异的检测北美H7亚型禽流感病毒,而对欧亚谱系H1N1、H3N2、H5N1、H5N8、H7N2、H7N9和H9N2亚型流感病毒,以及其他主要禽呼吸道RNA病毒(新城疫和传染性支气管炎病毒)RT-PCR检测结果均为阴性,表明该方法具有良好的特异性.该方法能检测出的最低质粒浓度为0.1 pg/μL,具有良好的敏感性.Spackman等人建立了针对北美H7亚型HA基因的实时荧光RT-PCR检测方法,其最低检出量与本研究相似,均为0.1 pg/μL[15].在我国,目前尚无关于北美H7亚型禽流感病毒检测方法的报道.因此,比较而言,本方法更经济适用.

因此,本文所建立的针对北美H7亚型流感病毒的检测方法特异性强、敏感性高、经济实用,可以作为检测北美H7亚型禽流感病毒外来疫病的监测方法,对防止其入境传播具有重要意义.

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RT-PCR assay for detection of North American H7 subtypeavian influenza virus

WANG Chen-xi,ZHANG Xu-xiao,SUN Hong-lei,PU Juan
(College of Veterinary Medicine,China Agricultural University,Beijing 100193,China)

In this study,a pair of specific oligo nucleotide primer was designed based on HA sequences available from NCBI database,and RT-PCR assay was established for the detection of North American H7 subtype AIV.The amplification by the RTPCR assay was positive for North American H7 AIVs but negative for Eurasian H7 subtype AIV(H7N2 and H7N9),other subtypes (H1N1,H3N2,H5N1,H5N8 and H9N2)of influenza viruses,Newcastle disease virus(NDV)and infectious bronchitis virus (IBV).The sensitivity was 0.1 pg/uL.This assay will provide a useful detection method for North American H7 subtype AIV in the surveillance of exotic diseases.

North American H7 subtype avian influenza virus;HA;RT-PCR

PU Juan

S852.65+5

A

0529-6005(2016)06-0028-03

2014-12-26

"十二五"国家科技支撑项目(2013BAD12B01)

王晨曦(1991-),女,硕士生,从事流感病毒研究工作,E-mail:wangchenxi911101@163.com

蒲娟,E-mail:pujuan@cau.edu.cn