桂明才，李　兵，戚思国，周长华

(1.四川省达州市中心医院耳鼻咽喉头颈外科 635000；2.重庆医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科，重庆400016)



·论著·

mTOR信号通路调控1,25二羟维生素D3抑制喉癌细胞Hep-2细胞增殖的研究*

桂明才1，李兵2△，戚思国1，周长华1

(1.四川省达州市中心医院耳鼻咽喉头颈外科 635000；2.重庆医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科，重庆400016)

目的研究1,25二羟维生素D3抑制喉癌细胞Hep-2细胞增殖作用以及对雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的影响。方法用不同剂量1,25二羟维生素D3(10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L)分别处理Hep-2细胞24、48、72 h，四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测Hep-2细胞的增殖情况，并计算抑制率；采用流式细胞仪分析1,25二羟维生素D3对Hep-2细胞周期分布的影响，Western blot检测1,25二羟维生素D3对mTOR信号通路的影响。结果不同浓度1,25二羟维生素D3均可抑制Hep-2细胞增殖，改变细胞周期分布,使G0/G1期Hep-2细胞比例增高。1,25二羟维生素D3干预后Hep-2细胞TSC1、TSC2蛋白表达较对照组增高(P<0.01)，Rheb蛋白表达明显降低；mTOR蛋白及其磷酸化水平表达与对照组比较均降低(P<0.01)，mTOR蛋白磷酸化表达降低尤为明显(P<0.01)；4EBP-1蛋白表达较对照组增高(P<0.01)。结论1,25二羟维生素D3改变喉癌细胞Hep-2细胞周期分布，影响mTOR信号通路蛋白表达，从而抑制细胞增殖。

1,25二羟维生素D3；Hep-2细胞；增殖抑制；雷帕霉素靶蛋白

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一种重要的调节基因，通过调节细胞周期、蛋白质合成、细胞能量代谢等途径发挥生理功能，在细胞增殖、生长、分化过程中起核心调控作用。mTOR还参与感受营养信号、调节细胞生长与增殖[1]。维生素D传统上被认为是一种脂溶性维生素。1,25二羟维生素D3[1,25(OH)2D3]是维生素D的活性形式。1,25(OH)2D3除了经典的调节肾、肠道的钙、磷代谢外，还具有调节细胞生长和分化的作用[2]，其中对肿瘤细胞的影响近年来倍受关注。本研究旨在观察1,25(OH)2D3抑制喉癌细胞Hep-2细胞增殖及其对mTOR信号通路的影响，初步探讨1,25(OH)2D3对Hep-2细胞增殖的影响及相关机制。

1　材料和方法

1.1材料人喉上皮样癌Hep-2 细胞株购自南京凯基生物有限公司；TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、p-mTOR和β-actin 单克隆抗体购自Santa Cruz公司；辣根过氧化酶标记物山羊抗小鼠IgG(二抗)购自北京中杉金桥生物技术有限公司；1,25(OH)2D3及雷帕霉素购自美国Sigma公司，溶于RPMI1640 培养基制成10 mmol/L的母液，过滤除菌后-20 ℃备用。

1.2方法

1.2.1细胞培养及实验分组人喉癌Hep-2 细胞接种于含10%胎牛血清的RPMI-1 640 培养液中，置入37 ℃、体积分数为5%的二氧化碳及饱和湿度培养箱中进行培养，取对数生长期细胞用于实验。按实验需要进行分组：对照组，干预组1[1,25(OH)2D3浓度为10-8mol/L]，干预组2[1,25(OH)2D3浓度为10-7mol/L]，干预组3[1,25(OH)2D3浓度为10-6mol/L]，雷帕霉素组(雷帕霉素浓度20 nmol/L)。

1.2.2细胞增殖抑制实验(MTT法)细胞分别培养24、48、72 h后各取出1块培养板，每孔加入MTT(5 g/L)20 μL，孵育4 h，弃上清液加入DMSO终止反应，振荡10 min，于波长570 nm处测吸光度(OD)值。细胞抑制率(%)=(OD阴性对照-OD实验)/OD阴性对照×100%。

1.2.3细胞周期检测将培养48 h的细胞用PBS冲洗后快速注入装有预冷750 mL/L乙醇1 mL的EP管中，混匀，4 ℃过夜。将等体积的细胞悬液和碘化丙啶(PI)染液混合，4 ℃放置30 min，以激发波长488 nm测定，死亡细胞呈红色荧光，以健康人淋巴细胞调节参数，数据用Modifit1.0软件分析。计算细胞增殖指数(PI)=(S+G2/M)/(S+G2/M+G0/G1)×100%。

1.2.4Western blotting检测各实验组培养48 h后提取细胞总蛋白。凝胶电泳，转膜。封闭后加稀释一抗抗体(靶蛋白抗体)4 ℃过夜。加入稀释的二抗室温孵育2 h，显色，曝光、显影和定影。吸光度扫描分析后计算各组细胞靶蛋白相对表达量。

2　结　果

2.11,25(OH)2D3对Hep-2细胞增殖的抑制作用1,25(OH)2D3在10-6～10-8mol/L浓度对Hep-2细胞增殖均有抑制作用，但程度不同，各剂量组对癌细胞的抑制率见图1。3个剂量组对喉癌细胞的抑制率随作用时间的延长以及药物浓度的上升而增加，且呈时间-剂量效应关系。各实验组与对照组之间差异有统计学意义(P<0.01)。

注：A为对照组；B为1,25(OH)2D3浓度10-8mmol/L；C为1,25(OH)2D3浓度10-7mmol/L；D为1,25(OH)2D3浓度10-6mmol/L。与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

图11,25(OH)2D3对Hep-2细胞增殖能力的影响

2.21,25(OH)2D3对喉癌细胞周期影响1,25(OH)2D3对细胞株Hep-2干预后，细胞周期分布及细胞增殖指数见表1和图2。不同浓度1,25(OH)2D3作用48 h后，G0/G1期细胞较对照组明显增多(P<0.05)，细胞增殖指数明显减少(P<0.05)。

表1　1,25(OH)2D3作用48 h后Hep-2细胞周期分布

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

注：A为对照组；B为1,25(OH)2D3浓度10-8mmol/L；C为1,25(OH)2D3浓度10-7mmol/L；D为1,25(OH)2D3浓度10-6mmol/L。

图21,25(OH)2D3对Hep-2细胞周期的影响

注：A为对照组；B为1,25(OH)2D3浓度10-8mmol/L；C为1,25(OH)2D3浓度10-7mmol/L；D为1,25(OH)2D3浓度10-6mmol/L；E为雷帕霉素干预组。

图31,25(OH)2D3对Hep-2细胞mTOR信号通路蛋白表达的影响

2.3Western blotting检测蛋白表达结果如图3所示，Hep-2细胞1,25(OH)2D3干预组与对照组比较TSC1、TSC2蛋白表达均增高，TSC2蛋白表达增高尤为明显(P<0.01)，随1,25(OH)2D3浓度增加，蛋白表达增高尤为明显，而雷帕霉素组表达改变不明显(P>0.05)；Rheb蛋白在1,25(OH)2D3干预后表达降低，不同浓度表达差异有统计学意义(P<0.01)，雷帕霉素组表达也降低(P<0.05)；mTOR蛋白及其磷酸化水平在1,25(OH)2D3干预后表达降低，mTOR蛋白磷酸化表达降低尤为明显(P<0.01)，雷帕霉素组mTOR蛋白改变不明显(P<0.05)，而mTOR蛋白磷酸化表达降低明显(P<0.01)；4EBP-1在1,25(OH)2D3干预后表达增高，不同浓度表达差异有统计学意义(P<0.01)，雷帕霉素组表达也增高(P<0.05)。

3　讨　论

喉鳞状细胞癌(LSCC)是头颈部常见的恶性肿瘤之一，占人类所有恶性肿瘤的2%[3-4]。虽然近几十年来传统的喉癌治疗方式已有很大提高，但喉癌患者总体生存率一直没有提高，因此寻求高效、低毒的抗肿瘤药物成为研究的热点。近年来研究发现，1,25(OH)2D3对乳腺癌、卵巢癌、白血病、淋巴瘤等肿瘤细胞均有抑制作用[5]。本实验发现1,25(OH)2D3可以抑制喉癌细胞株Hep-2细胞生长，该作用呈时间和剂量依赖关系，在作用48 h后抑制作用最为显著。细胞周期是细胞生命活动的基本过程，细胞增殖最终发生在细胞周期水平。以调节细胞周期为策略是抗肿瘤治疗的新途径，细胞周期阻滞包括G0/G1期阻滞和G2/M期阻滞。本研究结果显示，随着1,25(OH)2D3浓度的增加，Hep-2细胞G0/G1期所占比例逐渐上升，而G2/M期细胞和S期细胞所占比例逐渐下降。表明1,25(OH)2D3能使Hep-2细胞周期阻滞于G0/G1期。

mTOR 是肿瘤发生过程中的一个关键因子，主要是通过PI-3K/AKT/mTOR及AKT/TSC1-TSC2/mTOR 信号通路对细胞的生长和增殖产生调控作用，信号通路的过度激活和调控异常与肿瘤的发生密切相关[6]。1994年由PaulWorley发现Rheb，最初研究表明Rheb在诱导癫痫后的神经元表达增高，推测Rheb对外界应激反应中具有突触可塑性[7]。更有研究证明Rheb是TSC基因下游作用因子，具有内源性GTP酶活性，作为TSC2的靶分子，与有GTP酶激活蛋白(GAP)的TSC2直接作用[8]，而且在TSC患者中mTOR通路异常激活，而TSC蛋白和Rheb蛋白分别为mTOR通路的负性和正性调控因子[9]。

维生素D参与钙、磷代谢和维持骨稳态的调节。而较多研究发现其新的功能，研究表明，维生素D具有广泛的生物学活性，不仅在机体骨骼发育中发挥重要作用，而且具有调节细胞生长、分化、增殖和凋亡的重要作用[10-11]。在抗凋亡机制的研究中发现，1,25(OH)2D3能够在转录水平诱导DDIT4表达，后者可通过调控mTOR信号通路中TSC1/2复合物及Rheb的活性来抑制mTOR激活，而激活后的mTOR通过调控4EBP-1表达，从而抑制肿瘤细胞增殖。

本实验发现1,25(OH)2D3干预Hep-2细胞TSC1、TSC2蛋白表达与对照组比较均增高。而干预组Rheb蛋白表达降低、mTOR蛋白及其磷酸化水平降低、4EBP-1蛋白表达增高。同时设立mTOR抑制剂雷帕霉素作为对照，检测mTOR下游蛋白表达情况，发现mTOR蛋白及其磷酸化水平、4EBP-1蛋白表达水平与1,25(OH)2D3干预组类似。由此可见，1,25(OH)2D3抑制Hep-2细胞中Rheb表达、mTOR蛋白及其磷酸化水平，增加4EBP-1蛋白水平表达，抑制mTOR信号通路，影响TSC1/2/Rheb/mTOR/4EBP-1信号通路蛋白表达，从而抑制Hep-2细胞增殖。

本实验不足之处在于尽管参照了较多研究的文献进行1,25(OH)2D3浓度选择，但是就本部分实验的完整性而言需要进一步选择不同1,25(OH)2D3的作用浓度进行研究；检测了mTOR总的蛋白，而没有进行细胞核蛋白和膜蛋白的分别检测，这也是本课题组后期拟进一步检测的内容；本实验仅反映体外实验，尚无体内实验研究，需要进一步进行动物实验研究。本课题组将在后期实验中完善这一部分。

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mTOR signaling pathway for regulating inhibition of 1,25 dihydroxyvitamin D3on Hep-2 cells proliferation in laryngeal carcinoma*

GUI Mingcai1,LI Bing2△,QI Siguo1,ZHOU Changhua1

(1DepartmentofOtorhinolaryngologyHeadandNeckSurgery,DazhouMunicipalCentralHospital,Dazhou,Sichuan635000,China;2DepartmentofOtorhinolaryngology,FirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

ObjectiveTo explore the inhibition role of 1,25 dihydroxyvitamin D3on laryngeal cancer Hep-2 cell proliferation and its influence on mTOR signal pathway.MethodsHep-2 cells were treated with different concentrations of 1,25 dihydroxyvitamin D3(10-8,10-7,10-6mol/L) for 24,48,72 h respectively.The proliferation situation of Hep-2 cells was detected by the MTT method and the inhibition rate was calculated.The effect of 1,25 dihydroxyvitamin D3on Hep-2 cell cycle distribution was analyzed by flow cytometry.The influence of 1,25 dihydroxyvitamin D3on mTOR signaling pathway was detected by Western blot.ResultsDifferent concentrations of 1,25 dihydroxyvitamin D3could inhibit the proliferation of Hep-2 cells,changed the cell cycle distribution and increased the proportion of Hep-2 cells in G0/G1phase.The expressions of TSC1 and TSC2 protein after 1,25 dihydroxyvitamin D3intervention were increased compared with the control group(P<0.01),while the Rheb protein expression was significantly decreased(P<0.01):mTOR protein and phosphorylation level were significantly decreased compared with the control group (P<0.01),the decrease of mTOR protein phosphorylation was especially obvious(P<0.01);4EBP-1 protein expression was increased compared with the control group(P<0.01).Conclusion1,25-dihydroxyvitamin D3alters the Hep-2 cell cycle distribution,affects the protein expression of mTOR signaling pathway,thus inhibits the cell proliferation.

1,25 dihydroxyvitamin D3;Hep-2 cell;proliferation;mTOR

2016-02-02修回日期：2016-05-16)

重庆市自然科学基金资助项目(cstc2013jcyjA10059)。

桂明才，男，主治医师，主要从事耳鼻喉头颈外科方面的研究。△

，E-mail:634339717@qq.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.15.006

A

1673-4130(2016)15-2065-03