徐明忠，张如胜，苏　良

(湖南省长沙市疾病预防控制中心　410006)



·论著·

布鲁菌PCR快速检测方法的建立及应用*

徐明忠，张如胜，苏良

(湖南省长沙市疾病预防控制中心410006)

摘要:目的建立布鲁菌聚合酶链反应(PCR)方法，对其进行应用评价。方法针对布鲁菌外膜蛋白编码基因(omp-2)设计PCR引物，建立PCR方法，利用19种常见细菌和布鲁菌株DNA分别对其进行特异性和敏感度评价，对3株疑似布鲁菌株进行核酸检测，并与分离培养法进行结果比对。结果本研究建立的布鲁菌PCR检测方法仅能检出布鲁菌阳性菌株，对照菌DNA未出现目的条带；敏感度为100拷贝/反应；PCR方法对3株疑似布鲁菌株检出omp-2基因条带，鉴定结果为布鲁菌，与分离培养法结果相同。结论本研究建立了一种布鲁菌PCR检测方法，与分离培养法相比，布鲁菌PCR方法准确、快速，适合布鲁菌病疫情的快速检测。

关键词:布鲁菌;聚合酶链反应;基因

布鲁菌病(简称布病)是一种人畜共患传染病，人感染布鲁菌后出现反复发热，同时伴有乏力、关节痛等症状，容易发展为慢性病。布鲁菌分为6 个经典种和19 个亚型，不同种、型之间亲缘性很近[1]，其中布病主要由羊、牛、猪、犬种布鲁菌感染引起。近年来,布病疫情形势较为严峻,数据显示，2004年12月至2010年7月，中国共报告布病实验室诊断病例141 604例[2]。2012年，长沙市宁乡县发生布病疫情，为了对该疫情病原体进行准确、快速地检测，本文在分离培养法检测的同时，建立聚合酶链反应(PCR)方法对可疑布鲁菌菌株进行了核酸检测，现报道如下。

1材料与方法

1.1标本及菌株来源湖南省长沙市宁乡县疾病预防控制中心送检的布病疑似患者血液标本3例，布鲁菌阳性菌株及19株常见细菌菌株由本中心实验室保存。

1.2仪器与试剂MycyclerTMthermal cycler PCR 仪(美国Bio-Rad公司)；DYCP-31E型电泳仪(北京市六一仪器厂)；通用型核酸快速提取试剂盒(华瑞安生物)；Platinum®PCR SuperMix (美国invitrogen公司)。

1.3PCR引物针对布鲁菌外膜蛋白编码基因(omp-2)设计PCR引物(omp-2- F：5′-CCA GCC ATT GCG GTC GGT A-3′；omp-2-R：5′-GCG CTC AGG CTG CCG ACG CAA-3′，预期目的片段190 bp)，引物序列由上海Life Technologies公司合成。

1.4PCR扩增将布鲁菌阳性菌株，19株常见细菌菌株及3株疑似布鲁菌株提取DNA后保存于-20 ℃备用，根据实验目的分别利用omp-2 引物和PCR商品化试剂盒(invitrogen Platinum®PCR SuperMix)进行omp-2基因PCR扩增，反应体积共25 μL：Platinum®PCR SuperMix 23.0 μL；20 μmol/Lomp-2-F、omp-2-R引物各0.5 μL，待检DNA 1.0 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min，再按94 ℃ 15 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s循环30次。PCR扩增完成后取5 μL产物进行琼脂糖凝胶电泳(100 V 30 min)，观察有无预期目的片段(190 bp)。

1.5分离培养鉴定将3例疑似布病患者无菌静脉血(5 mL)分别注入2个含双相培养基的血培养瓶中，轻轻混合倾斜，使被检血液均匀分布在琼脂斜面上，置37 ℃温箱培养，3 d后观察结果。如未见布鲁菌生长，可按上述方法再倾斜，使血液均匀涂在琼脂斜面上，继续培养，每隔1 d观察1次，如有可疑布鲁菌菌落，可分纯至琼脂试管培基，进一步作布鲁菌鉴定，血培养30 d仍不出菌，判定为阴性。

2结果

2.1PCR方法特异性分析结果1株布鲁菌(第20泳道)在PCR反应中出现目的条带(190 bp)，结果为阳性，其他19种常见对照细菌均为阴性，表明PCR反应特异性强，见图1。

注：M为100 bp DNA Marker；1为金黄色葡萄球菌；2为肠炎沙门菌；3为鼠伤寒沙门氏菌；4为伤寒沙门氏菌；5为单核细胞增多性李斯特氏菌；6为英诺克李斯特菌；7为变形杆菌属;8为奇异变形杆菌;9为肠致病型大肠杆菌;10为产志贺毒素大肠杆菌;11为肠出血型大肠杆菌;12为大肠杆菌;13为副溶血性弧菌;14为铜绿假单胞菌;15为肠侵袭型大肠杆菌;16为痢疾志贺菌;17为宋内氏志贺菌;18为鲍氏志贺菌;19为福氏志贺菌;20为布鲁菌。

图1布鲁菌PCR检测方法特异性扩增电泳图

2.2PCR反应敏感度结果将PCR特异性分析中扩增出的布鲁菌阳性PCR扩增产物进行TA克隆、测序验证后构建质粒(大连宝生物生物技术公司完成)。然后利用本研究建立的布鲁菌PCR方法同时检测10倍系列稀释的布鲁菌DNA质粒(1.0×100～1.0×105copies/μL)来评价布鲁菌PCR方法敏感度。检测结果显示1～4泳道出现预期目的条带(190 bp),PCR反应敏感度为100 拷贝/反应，表明本研究建立的布鲁菌PCR方法敏感度高。见图2。

注：M为100 bp DNA Marker；1～6分别为1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100拷贝/反应。

图2布鲁菌 PCR方法敏感度分析

2.3分离培养法鉴定结果3例疑似布病患者血液标本经1周左右培养，均生长出无色透明、圆形、针尖大小的疑似布鲁菌菌落(编号分别为NX201201、NX201202、NX201203)，进一步菌落转种和血清凝集试验鉴定为布鲁菌。

2.4疑似布鲁菌PCR扩增结果利用布鲁菌特异性基因引物(omp-2-F、omp-2-R)对NX201201、NX201202、NX201203株DNA进行PCR扩增，均出现190 bp的预期omp-2基因片段，扩增结果表明上述3株菌均为布鲁菌。见图3。

注：M为100 bp DNA Marker；1、2、3分别为NX201201、NX201202、NX201203菌株omp-2基因PCR扩增产物。

图33株疑似布鲁菌PCR电泳图

3讨论

目前，针对布病的检测主要依赖分离培养法和免疫学方法[3],分离培养方法是金标准，但分离培养鉴定耗时较长，且易受病期的长短、抗菌药物治疗等因素的影响而降低布鲁菌分离的阳性率；免疫学方法(虎红平板凝集试验、试管凝集试验)简便、快速，适合布病的大面积筛检，但也存在不能区分现症和既往感染、自然感染和布病疫苗免疫后出现的抗体等不足之处，需要和其他方法联合应用来确诊布病的感染。随着分子生物学技术的发展，国内外有较多采用PCR方法(荧光定量PCR方法、普通PCR方法)进行布鲁菌检测的报道[4-5],Debeaumont等[6]利用荧光定量PCR方法对疑似布病患者的血液标本进行了检测，结果表明该方法适用于分离培养方法结果阴性或免疫学诊断存在抗体交叉反应的布病患者的诊断；文献[7]利用荧光定量PCR方法对1例布鲁菌型脊髓炎患者进行了诊断,相比常规培养方法，该方法具有较高的特异性和敏感性；但同时荧光定量PCR由于需要昂贵的荧光定量PCR仪和较高的试剂成本而限制了其广泛的应用[8]。文献[9]利用PCR方法对布鲁菌进行了筛查和分型鉴定研究，该研究不但可以对布鲁菌属进行检测，还可以鉴定出牛、羊、猪种布鲁菌，同时还证实PCR方法的特异性和灵敏性均高于血清凝集试验。

本研究参考文献[10],针对omp-2设计PCR引物，配合invitrogen公司的Platinum®PCR SuperMix，建立布鲁菌属PCR检测方法，成功将NX201201、NX201202、NX201203菌株鉴定为布鲁菌，和分离培养方法结果相同；相比分离培养方法，本研究建立的布鲁菌属PCR方法具有快速，准确的优势；相比荧光定量PCR方法，本方法具有经济便宜(无需昂贵的荧光定量PCR仪和合成探针)和引物保存时间较长的优势，适合突发布病疫情的快速检测。同时普通PCR方法扩增后的产物可以直接进行核苷酸测序和基因分析，本研究中的NX201201、NX201202、NX201203菌株即通过PCR产物直接测序证实为羊种布鲁菌。本研究建立的PCR方法仅能确定是否为布鲁菌，尚不能进行分型鉴定是其不足之处，下一步将尝试分型鉴定和对血液标本提取核酸后直接进行PCR扩增，来减少布病职业暴露的风险。

参考文献

[1]钟志军，于爽，徐杰，等．布鲁氏菌比较基因组学研究进展[J]．中国人兽共患病学报，2011，27(4)：346-350．

[2]刘志国，罗成旺，张利，等．多重荧光定量PCR方法鉴定布鲁氏菌属及牛羊种布鲁氏菌研究[J]．中国人兽共患病学报，2012，28(9)：869-874．

[3]Leal-Klevezas DS,Martínez-Vázquez IO,López-Merino A,et al.Single-step PCR for detection of Brucella spp.from blood and milk of infected animals[J].J Clin Microbiol,1995,33(12):3087-3090.

[4]曾瑞霞，苏玉虹．布鲁氏杆菌各类检测方法的比较[J]．现代畜牧兽医，2006(5)：65-70．

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[7]Navarro-Martínez A,Navarro E,Casta MJ,et al.Rapid diagnosis of human brucellosis by quantitative real-time PCR:a case report of brucellar spondylitis[J].J Clin Microbiol,2008,46(1):385-387.

[8]Tcherneva E,Rijpens N,Jersek B,et al.Differentiation of brucella species by random amplified polymorphic DNA analysis[J].J Appl Microbiol,2000,88(1):69-80.

[9]湛志飞，张红，黄一伟，等．一例输入性布鲁菌病的病原学诊断[J]．实用预防医学，2009，16(6)：1799-1800．

[10]李坚，李铁锋，王艾琳．用PCR法对布鲁氏菌进行筛查及分型鉴定的研究[J]．中国地方病防治杂志，2009，24(4)：300-302．

*基金项目：湖南省卫生和计划生育委员会科研课题项目(B2015-153)。

作者简介：徐明忠，男，副主任技师，主要从事临床检验工作。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.13.005

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)13-1760-03

(收稿日期：2016-02-23修回日期：2016-05-04)

Establishment and application of a rapid PCR detection method of Brucella spp.*

XUMingzhong,ZHANGRusheng,SULiang

(ChangshaMunicipalCenterforDiseaseControlandPrevention,Changsha,Hunan410006,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a polymerase chain reaction(PCR) method for detecting Brucella spp. and to evaluate its application.MethodsThe PCR primer aiming at the outer membrane protein(omp-2) coding gene were designed and the PCR method for detecting Brucella spp. was established.By using DNA of 19 kinds of common bacteria and Brucella spp.,the specificity and sensitivity were evaluated.Three strains of suspected Brucella spp. were performed the nucleic acid detection.Then,3 suspected strains of Brucella spp. were amplified by the PCR method with omp-2 gene，and the results were compare to the those by the culture method.ResultsThe established Brucella spp. PCR detection method could only detect the Brucella spp. positive strain,the control bacterium DNA did not appear the target band;the sensitivity was 100 copies/response;the PCR method detected omp-2 gene band in 3 strains of suspected Brucella spp.,which was identified as Brucella spp. and was same to the results by the isolation culture method.ConclusionThe established PCR method for detecting Brucella spp. is accurate and rapid compare with the isolation and culture method,which is suitable for the rapid detection of brucellosis epidemic situation.

Key words:Brucella spp.;polymerase chain reaction;gene