李　冉，王尧尧，李运生，方富贵，李福宝

(安徽农业大学 动物科技学院，安徽 合肥 230036)

Nesfatin-1及其mRNA在大鼠生长轴中的表达

李冉，王尧尧，李运生，方富贵，李福宝

(安徽农业大学 动物科技学院，安徽 合肥 230036)

[摘要]【目的】 探讨Nesfatin-1在大鼠生长轴(下丘脑、腺垂体、肝脏、胰腺、肌肉)中的定位及其mRNA的表达情况。【方法】 对雌性大鼠进行深度麻醉灌注后，采集下丘脑、腺垂体、肝脏、胰腺、腓肠肌肌肉组织，放入4%多聚甲醛溶液中固定，采用免疫组化PV-9000二步法、DAB显色技术检测Nesfatin-1在生长轴上的分布，另取雌性大鼠断头处死，取相同组织用荧光定量PCR方法检测其中Nesfatin-1 mRNA的表达情况。【结果】 Nesfatin-1主要分布于下丘脑的室旁核、背内侧核、室周核、外侧区、弓状核、视上核、腺垂体、胰腺的胰岛和腺泡及肝脏与肌肉中。平均光密度分析显示，Nesfatin-1在室周核和胰岛的表达量显著地高于其他组织(P<0.05)，在胰腺腺泡、肝脏及肌肉中的表达量则显著地低于其他组织(P<0.05)，在下丘脑背内侧核、外侧区和室旁核中的表达量显著高于视上核、弓状核和腺垂体(P<0.05)。Nesfatin-1 mRNA在胰腺中表达量最高，腺垂体次之，下丘脑和肝脏较低，在胰腺和腺垂体的表达量显著高于下丘脑和肝脏，但下丘脑与肝脏差异不显著(P>0.05)；在腓肠肌中未检测出Nesfatin-1 mRNA的表达。【结论】 Nesfatin-1及其mRNA在生长轴中的广泛表达，表明Nesfatin-1可能对大鼠生长发育具有调控作用。

[关键词]Nesfatin-1；大鼠；生长轴；表达与调控

2006年，日本教授OH-Is首次报告了存在于下丘脑的神经肽Nesfatin-1，其为核组蛋白2(NucleobindinⅡ, 简称NUCB2)的裂解产物，NUCB2在前激素酶的作用下可以裂解成3个片段，分别命名为Nesfatin-1、Nesfatin-2及Nesfatin-3[1]。进一步的试验研究发现，只有Nesfatin-1在注入大鼠脑内后，其摄食量呈剂量依赖性减少，提示3个片段中，仅Nesfatin-1对摄食具有抑制功能[1-2]。另有研究发现，NUCB2 mRNA在脑中主要分布于皮层、边缘、脑桥，下丘脑背内侧核(Dorsomedial hypothalami nucleus，DMH)、外侧区(Lateral hypothalami area，LHA)、视上核(Supraoptic nucleus，SON)、室旁核(Nucleus paraventricular，PVN)、弓状核(Hypothalami arcuate nucleus，ARC)、室周核(Periventricular nucleus，PeN)和下丘脑正中隆起，延髓中缝核、孤束核，以及背侧迷走神经运动核、交感神经节前、副交感神经元等[3-5]。另外，Nesfatin-1还广泛分布于外周消化系统中,如RT-PCR检测到大鼠胃分泌黏膜的NUCB2 mRNA较脑部高10倍[6-7]。Nesfatin-1在中枢和外周的广泛分布提示其具有多种生物学功能，近来年的研究还表明，Nesfatin-1不仅能够抑制饮食饮水，还具有调节生物体的肥胖、胰岛素分泌及生殖等功能[8-9]。

摄食是生物体生命延续的最基本需求之一，通过进食生命体才能生长、发育[10]。鉴于Nesfatin-1对动物体的摄食行为有抑制作用，而生长主要由生长轴调控，由此推测Nesfatin-1与生长轴密切相关，但Nesfatin-1及其mRNA在生长轴中的分布与表达情况还未见报道。为此，本试验采用免疫组化及实时荧光定量PCR(Realtime fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR)对Nesfatin-1在大鼠生长轴中的表达情况进行检测，以期为进一步研究Nesfatin-1在生长方面的作用提供科学依据。

1材料与方法

1.1试验动物

成年雌性SD大鼠(体质量220～250 g/只)10只，购自安徽医科大学实验动物中心，在室温(23±2) ℃、12 h(昼)/12 h(夜)循环光照条件下自由摄食与饮水。

1.2试剂及仪器

1.2.1免疫组化所用主要试剂和仪器Nesfatin-1一抗为山羊抗鼠Nesfatin-1多克隆抗体(AF6895)，美国R&D公司；PV-9000两步法免疫组化检测试剂盒及DAB显色试剂盒，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。半自动石蜡切片机(LS-2055+)，沈阳市龙首电子仪器有限公司。

1.2.2荧光定量PCR所用主要试剂和仪器TRIzol、DEPC、引物、RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit、QuantiFast SYBR Green PCR kit，均购自上海闪晶分子生物科技有限公司；DNA Marker DL2000，TAKARA。荧光定量PCR仪，Thermo PIKOREAL 96；紫外分光光度计，Gene Quant Ⅱ，Pharmacia Biotech。

1.3组织样品的采集

取5只SD雌性大鼠，腹腔注射10%(质量浓度0.1 g/mL)水合氯醛进行深度麻醉，注射剂量为5 mL/kg，使用0.9%生理盐水溶液进行心脏快速灌注冲洗，然后用4%多聚甲醛溶液灌注。打开大鼠颅腔，采集下丘脑(以灰结节和视交叉之间的中心点为中心确定下丘脑组织，前界为视交叉前缘，后界为乳头体后缘，两侧为颞侧沟，宽约4 mm，深约2 mm，长约4 mm[11])、腺垂体、肝脏、胰腺、腓肠肌肌肉组织，放入4%多聚甲醛溶液中固定。其余5只SD大鼠断头处死，开颅取下丘脑、整个垂体、肝脏、胰腺、腓肠肌装入无RNA酶的EP管中，置于液氮速冻后，转到-80 ℃冰箱中保存待用。

1.4Nesfatin-1表达的免疫组化检测

1.4.1组织切片的制作将上述固定24 h的组织经流水充分洗涤后，修整，依次经体积分数50%，70%，80%，95%，100%酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片(片厚5 μm)。以上组织各制备2套切片，分别作为免疫组化组和阴性对照组备测。

1.4.2免疫组织化学染色免疫组化组切片化学染色程序按试剂盒说明书进行；对照组用PBS代替一抗，其余步骤同免疫组化组。

1.4.3图像采集光学显微镜下拍照(400×)，参考雌性大鼠下丘脑各核团图谱[12]分别采集照片，获取Nesfatin-1在下丘脑室旁核、外侧区、弓状核、背内侧核、室周核、腺垂体、肝脏、胰腺胰岛和腺泡及肌肉中的免疫阳性部位照片。每个动物每个组织选5张照片，采用江苏捷达科技JEDA801D形态分析系统分析平均光密度。

1.5Nesfatin-1 mRNA的实时荧光定量PCR检测

1.5.1组织中总RNA的提取及cDNA的合成用TRIzol提取总RNA，经1%琼脂糖-甲醛变性凝胶电泳，检测RNA完整性，紫外分光光度计测定RNA样品浓度及纯度。每个RNA样品取3 μg反转录为cDNA，于-80 ℃保存。

1.5.2引物设计和合成根据GenBank数据库中大鼠β-actin和NUCB2基因序列(GenBank序列号分别为NM_031144和NM_021663.2)，采用Primer express 3.0软件分别设计β-actin和Nesfatin-1 mRNA扩增引物，交由Invitrogen公司合成。基因引物序列如表1所示。

表 1　实时荧光定量PCR引物序列

1.5.3Nesfatin-1 mRNA的实时荧光定量PCR检测按SYBR Premix ExTaqTMⅡ说明进行RT-PCR：分别取2 μL cDNA、2 μL Primers、25 μL Buffer、0.5 μL SYBR green Ⅰ，加DEPC水至终体积为50 μL。NUCB2的PCR反应条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环。采用2-ΔΔCt(Relative Quantification Study)方法计算Nesfatin-1 mRNA的相对表达量。每个样本重复3次。

1.6数据的统计与分析

所有数据采用SPSS 19.0软件进行统计与分析，以P<0.05表示差异显著。

2结果与分析

2.1Nesfatin-1在大鼠生长轴中表达的免疫组化染色分析

Nesfatin-1在下丘脑的背内侧核(图1-A)、外侧区(图1-B)、视上核(图1-C)、室周核(图1-A，D，E)、室旁核(图1-D)、弓状核(图1-E)及腺垂体(图1-F，G)、肝脏(图1-H)和胰腺胰岛、腺泡(图1-I)等部位均有阳性表达。而在腓肠肌肌肉中的表达呈弱阳性(图1-J)，阴性对照组均呈阴性(图1-K，L)。对采集的照片进行平均光密度值分析，结果(图2)表明：室周核与胰腺胰岛的平均光密度值最高，显著高于其他组织(P<0.05)，胰腺腺泡、肝脏及肌肉的平均光密度值则较低(P<0.05)；另外，背内侧核、外侧区和室旁核的平均光密度值显著高于视上核、弓状核、腺垂体(P<0.05)，但背内侧核、外侧区和室旁核间及弓状核、视上核与腺垂体之间差异均不显著(P>0.05)。

2.2Nesfatin-1 mRNA在雌性大鼠生长轴中的表达

由图3可知，在成年雌性大鼠下丘脑、腺垂体、肝脏、胰腺中，Nesfatin-1 mRNA均有不同程度的表达，其中以胰腺中的表达量最高，腺垂体次之，下丘脑和肝脏较低，胰腺和腺垂体的表达量显著高于下丘脑和肝脏，但下丘脑与肝脏间差异不显著(P>0.05)。在腓肠肌中未检测出Nesfatin-1 mRNA的表达。

3讨论

3.1Nesfatin-1在下丘脑的表达

机体的摄食和能量的调控由下丘脑复杂的神经环路来完成，其中以下丘脑PVN、LHA和ARC区尤为重要[13]。有研究表明，约19%的ARC神经元共表达Nesfatin-1和神经肽Y(NPY)，而通过下丘脑ARC神经元全细胞电流钳技术则发现，Nesfatin-1可导致NPY神经元超极化，提示其可能通过抑制NPY神经元及激活钾离子通路来引起厌食[14]。李志玲等[15]认为，Nesfatin-1参与了对ARC神经元电活动及胃运动的调控。Shimizu等[16]则发现，通过使用迷走神经阻滞剂辣椒素可消除通过外周神经注射Nesfatin-1而引起的抑食作用，提示Nesfatin-1可能通过激活迷走神经调节摄食信号的传导，从而起到抑制进食的作用。机体的生长离不开摄食，而Nesfatin-1对摄食产生的作用势必会影响到机体的生长。

下丘脑的神经内分泌小细胞分泌包括生长激素释放激素(Growth hormone releasing hormone，GHRH )、生长激素抑制激素(Somatostatin，SS)、促甲状腺激素释放激素(Thyrotropin-releasing hormone(TRH))等在内的9种激素。本试验通过免疫组织化学的方法验证了Nesfatin-1阳性细胞在DMH、LHA、ARC、PVN、PeN中的分布。这与Foo等[17]认为在小细胞内分泌神经元中，Nesfatin-1与SS和GHRH共区域相吻合。Garcia-Galiano等[18]的研究发现，在雌性大鼠从幼年期向青春期过渡过程中，Nesfatin-1 mRNA在其下丘脑PVN、LHA和SON部位的表达量上升了3倍。Nesfatin-1阳性细胞的分布特点及其表达量随年龄的不同而不同，该结果也提示其可能与机体各种生长激素及抑制激素存在一定程度的相关性。

图 1Nesfatin-1在雌性成年大鼠生长轴中的定位分析

A.下丘脑背内侧核(DMH)和室周核(PeN)；B.下丘脑外侧区(LHA)；C.下丘脑视上核(SON)；

D.下丘脑室旁核(PVN),PeN；E.下丘脑弓状核(ARC),PeN；F、G.腺垂体；H.肝脏；

I.胰腺胰岛，腺泡；J.肌肉；K.下丘脑阴性对照；L.腺垂体阴性对照；箭头所示为Nesfatin-1阳性细胞

Fig.1Localization of Nesfatin-1 in the growth axis of female rats

A.Dorsomedial hypothalamic nucleus (DMH),Periventricular nucleus (PeN) of the hypothalamus;

B.Hypothalamic lateral area(LHA);C.Hypothalamic supraoptic nucleus(SON);D.paraventricular nucleus(PVN),PeN;

E.Hypothalami arcuate nucleus(ARC),PeN;F and G.Anterior pituitary;H.Liver;I.Pancreatic islet,Pancreatic acini J.Muscle;

K.Negative control;L.Negative control for anterior pituitary.Arrows show the immunoreactive cells of Nesfatin-1

图 2　Nesfatin-1阳性细胞在大鼠生长轴上的表达量分析

图 3　Nesfatin-1 mRNA 在成年雌性大鼠生长轴中的表达

3.2Nesfatin-1在垂体中的表达

垂体可以分为腺垂体和神经垂体，作为机体重要的内分泌腺，其在调节动物体机体平衡、生长、生殖等各方面激素的分泌中发挥着重要的作用。目前针对Nesfatin-1在动物体垂体中的分布和作用尚鲜有报道。本试验结果显示，Nesfatin-1阳性细胞在腺垂体中有大量分布，且mRNA相对含量显著高于下丘脑。这与Foo等[17]所报道的其存在于腺垂体前叶的结果相类似。腺垂体细胞主要分泌包括生长激素、促性腺激素在内的多种激素，Nesfatin-1在腺垂体中的分布，与动物种类、年龄等各方面是否有关尚不明确。Gonzalez等[9]对金鱼腹腔注射Nesfatin-1，其促黄体素(Luteinizing hormone，LH)和促卵泡素(Follicle-stimulating hormone，FSH ) mRNA的表达量会有所下降。Tadross等[19]报道，对雄性大鼠脑室注射Nesfatin-1，可以促进其LH和FSH的分泌，并且能够刺激下丘脑释放GnRH。Lents等[20]报道，在青春期前的猪中，侧脑室注射Nesfatin-1能促进LH的分泌。这表明在不同物种中，Nesfatin-1的作用方式也不尽相同。而上述研究多是基于外源性Nesfatin-1对动物生殖方面的影响，对生长激素的分泌是否有影响则鲜有报道，因此尚有待进一步研究。

3.3Nesfatin-1在肝脏、胰腺及肌肉中的表达

本试验通过免疫组织化学方法分析明确了Nesfatin-1在胰腺、肝脏及腓肠肌中均有分布，在胰腺中Nesfatin-1阳性细胞存在于胰岛细胞及腺泡中，这与Gonzalez等[21]发现Nesfatin-1前体与胰岛素共存的结论相吻合。另据Mohan等[8]报道，在大鼠的生长发育过程中，Nesfatin-1与胰岛β细胞共同释放，二者表达的比率与大鼠年龄相关，在大鼠产后的13，20，27 d中，其血清中的Nesfatin-1水平随着大鼠的生长而持续升高，表明器官的发育与Nesfatin-1的含量有着密不可分的关系。肝脏作为GH的主要靶器官，是产生胰岛素样生长因子的最主要部位，在促进生长、代谢及机体免疫功能调节等多方面都有重要作用[22]。因而笔者认为，Nesfatin-1不仅通过摄食来影响机体的生长发育，其在大鼠生长轴上的分布程度提示其可能直接参与了多种生长激素及抑制激素的表达。通过免疫组织化学分析发现，Nesfatin-1在腓肠肌中有较弱的表达，但在腓肠肌中则未检测出Nesfatin-1 mRNA的表达，推测腓肠肌中的Nesfatin-1抗原是由其他器官分泌至其中的，在此过程中，由于Nesfatin-1 mRNA半衰期短，其短时间内即被降解，所以未被检测到。

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Expression of Nesfatin-1 and its mRNA in growth axis of rats

LI Ran,WANG Yao-yao,LI Yun-sheng,FANG Fu-gui,LI Fu-bao

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei,Anhui230036,China)

Abstract:【Objective】 In the paper,expression of Nesfatin-1 mRNA in growth axis of rats including hypothalamus,pituitary,liver,pancreas,and muscle was explored.【Method】 After deep anesthesia perfusion,hypothalamus,adenohypophysis,liver,pancreas,and gastrocnemius muscle of female rats were collected and fixed in 4% paraformaldehyde solution.Then,immuno-histochemical PV-9000 2-step method and DAB staining technique were used to detect the distribution of Nesfatin-1.Other female rats were beheaded and same tissues were collected and the expression was measured using fluorescence quantitative polymerase chain reaction (PCR).【Result】 Nesfatin-1 mainly distributed in the hypothalamic paraventricular nucleus (PVN),dorsomedial nucleus(DMH),periventricular nucleus(PeN),lateral hypothalamic area(LHA),arcuate nucleus(ARC),supraoptic nucleus(SON),pituitary,pancreas islet and acinar cells,liver,and muscle.Average optical density of Nesfatin-1 in PeN and pancreatic islet was significantly higher (P<0.05) than in other tissues while that in pancreatic acini,liver and muscle was significantly lower (P<0.05).The expression in hypothalamic DMH,LHA and PVN was significantly different from in SON,ARC and anterior pituitary.The expression level of Nesfatin-1 mRNA in pancreas was the highest followed by pituitary,while the expression in liver and hypothalamus was the lowest.No expression of Nesfatin-1 mRNA was observed in muscle.【Conclusion】 Nesfatin-1 and its mRNA widely distribute in the growth axis,indicating that Nesfatin-1 may participate in regulation of growth and development in rats.

Key words:Nesfatin-1;rat;growth axis;expression and regulation

DOI：网络出版时间:2016-05-0314:0510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.06.004

[收稿日期]2014-10-29

[基金项目]高等学校博士学科点专项科研基金博导类资助项目(20123418110004)

[作者简介]李冉(1990-)，女，安徽泗县人，在读硕士，主要从事动物组织胚胎及神经内分泌研究。 [通信作者]李福宝(1953-)，男，安徽蚌埠人，教授，主要从事动物解剖与神经内分泌研究。E-mail:lfb@ahau.edu.cn

[中图分类号]Q983+.5；Q42

[文献标志码]A

[文章编号]1671-9387(2016)06-0023-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160503.1405.008.html