耿　良，范　敬，高启龙，俞　静，花宝金

(1. 郑州大学附属肿瘤医院，河南省肿瘤医院中西医科，郑州　450008； 2. 河南中医药大学，郑州　450008； 3. 首都医科大学附属北京友谊医院肿瘤科，北京　100050； 4.中国中医科学院广安门医院肿瘤科，北京　100053)

·论著·

人参皂苷Rg3和PEG-PLGA-Rg3纳米微粒对Lewis肺癌小鼠的作用及其机制

耿良1，范敬2，高启龙1，俞静3，花宝金4△

(1. 郑州大学附属肿瘤医院，河南省肿瘤医院中西医科，郑州450008； 2. 河南中医药大学，郑州450008； 3. 首都医科大学附属北京友谊医院肿瘤科，北京100050； 4.中国中医科学院广安门医院肿瘤科，北京100053)

[摘要]目的：观察并比较20(R)-人参皂苷Rg3[20(R)-ginsenoside Rg3，Rg3]和聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)-聚乳酸羟基乙酸(poly lactic-co-glycolic acid，PLGA)-Rg3纳米微粒(Rg3-N)对Lewis肺癌荷瘤小鼠的影响，探讨它们体内抗肿瘤作用的机制。方法： 建立小鼠Lewis肺癌动物模型，60只小鼠随机分为人参皂苷Rg3纳米微粒组(Rg3-N)、PEG-PLGA纳米载体组(PEG)、20(R)-人参皂苷Rg3单体组(Rg3)、生理盐水组(NS)和空白对照组(C)，每组12只，灌胃给药共14 d。每隔2 d测量小鼠的体重并绘制小鼠体重变化曲线，观察各组小鼠毛色、活动和精神状态等一般情况。实验结束当天处死小鼠，计算抑瘤率和肿瘤质量与体重比值；免疫组织化学法CD31抗体标记来计算微血管密度(microvessel density，MVD)，以评价Rg3和Rg3纳米缓释微粒的体内抗血管生成作用，并通过实时定量PCR、免疫组织化学和Western blot法检测基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)、缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、Ki-67等血管新生和细胞增殖相关因子水平，以探讨其体内抗肿瘤作用的分子机制。结果： NS组和PEG组小鼠的体重呈现先升后降的趋势，而其余3组小鼠的体重则呈现逐渐上升并保持稳定的趋势。相对于NS组，Rg3组和Rg3-N组小鼠的毛色更亮，精神状态更好，更加活跃，一般状况较好。PEG组、Rg3组和Rg3-N组的肿瘤质量与NS组相比差异无统计学意义，但Rg3组和Rg3-N组的肿瘤质量与体重比值和微血管密度明显下降，与NS组之间差异有统计学意义(P<0.01)，Rg3组和Rg3-N组之间差异无统计学意义。与NS组相比，Rg3组和Rg3-N组的VEGF mRNA、MMP-9、HIF-1α、VEGF的蛋白表达显著下降，且Rg3-N组上述各指标相对于Rg3组有进一步降低的趋势，PEG组、Rg3组和Rg3-N组Ki-67的表达均未见明显差异。结论： 人参皂苷Rg3和PEG-PLGA-Rg3纳米微粒能抑制Lewis肺癌小鼠VEGF、MMP-9和HIF-1α的表达，从而间接地发挥它们的抗肿瘤作用，并改善小鼠的一般状况；此外，PEG-PLGA纳米微粒包埋可以增强Rg3的体内抗肿瘤作用。

[关键词]人参皂苷Rg3；纳米粒子；癌，Lewis肺；血管生成

20(R)-人参皂苷Rg3[20(R)-ginsenosideRg3，Rg3]是扶正中药人参的主要活性成分之一，具有抑制肿瘤新生血管形成[1]、调节免疫[2]、防止肿瘤复发、扩散和转移的作用[3]，因而在国内外受到广泛关注。为了进一步提高20(R)-人参皂苷Rg3的生物利用度和临床疗效，本研究用聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)/聚乳酸羟基乙酸(polylactic-co-glycolicacid，PLGA)纳米载体包埋Rg3，制备出PEG-PLGA-Rg3纳米微粒，并通过动物实验比较其与Rg3单药对Lewis肺癌小鼠的影响。

1材料与方法

1.1药物

人参皂苷Rg3单体由大连天富科技开发有限公司提供，纯度>99%。Rg3纳米微粒由北京交通大学生命科学与生物工程研究院制备，经微孔滤膜法测定，微粒的载药量较为满意，达到每毫克微球载药368μg，二者均用无菌PBS配置成混悬液，保存于4 ℃备用。

1.2主要试剂

反转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒购自美国Promega公司；Trizol购自美国Invitrogen公司；BCA蛋白定量试剂盒购自美国Pierce公司；β-actin单克隆抗体(#4970)购自美国CellSignaling公司；缺氧诱导因子-1α(hypoxiainduciblefactor-1α，HIF-1α)多克隆抗体(ab85886)、血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)多克隆抗体(ab46154)、基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase-9，MMP-9)多克隆抗体(ab38898)、Ki-67多克隆抗体(ab66155)购自英国abcam公司；血小板-内皮细胞黏附分子(plateletendothelialcelladhesionmolecule-1，PECAM-1/CD31)单克隆抗体(sc101454)购自美国SantaCruze公司。

1.3实验动物及分组

实验动物为健康雄性C57小鼠，4～6周龄，体重16～18g，共60只，购于中国科学院实验动物中心，喂养于中国中医科学院广安门医院清洁级动物室。随机分为空白对照组(C)、生理盐水组(NS)、PEG-PLGA纳米载体组(PEG)、Rg3单体组(Rg3)和Rg3纳米微粒组(Rg3-N)5组，每组12只。

瘤株：小鼠Lewis肺癌瘤株购于中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。

1.4建立Lewis肺癌动物模型

参考文献[4]方法，除C组外的每只小鼠右腋皮下接种0.2 mL瘤细胞悬液(约2×106个细胞)。

1.5动物处理方法

NS组于造模后第2天，给予生理盐水灌胃,其余4组均于同日开始灌胃，参考临床使用剂量和文献[5-6]，Rg3组给予Rg3[40mg/(kg·d)]灌胃，PEG组予PEG-PLGA纳米载体[40mg/(kg·d)]灌胃，Rg3-N组予Rg3纳米微粒[40mg/(kg·d)]灌胃，C组给予生理盐水灌胃，各组均为每日1次，每次0.2mL，共计14d。

1.6取材及检测指标

每隔2d测量小鼠的体重并绘制小鼠体重变化曲线，观察各组小鼠毛色、活动和精神状态等一般情况，计算各组小鼠的病死率，比较各组小鼠的总体生存情况。

于实验结束当天，摘眼球法取血后处死小鼠，剥离瘤组织并称其质量，计算抑癌率和肿癌质量与体重比值，抑瘤率=(1-实验组平均瘤质量/对照组平均瘤质量)×100%，肿瘤质量与体重比值=平均瘤质量/平均小鼠体重×100%，取瘤组织进行下列分子生物学指标检测。

1.7实时定量PCR法检测VEGF基因表达

从GenBank数据库中获得小鼠VEGF的cDNA序列，设计引物序列如下：VEGF上游引物5′-ATGAACTTTCTGCTCTCTGG-3′，下游引物5′-TCAT-CTCTCCTATGTGCTGGC-3′；以β-actin为内参，上游引物5′-ACTCGTCATACTCCTGCT-3′，下游引物5′-GAAACTACCTTCAACTCC-3′。

按照Trizol使用说明从瘤组织中提取细胞总RNA，以提取的总RNA为模板，按照反转录试剂盒说明书合成cDNA，并以之为模板采用实时荧光定量PCR试剂盒进行基因扩增，热循环参数：95 ℃，2min→(95 ℃，15s+60 ℃，60s)×40个循环→60 ℃，15s→95 ℃，15s。

以β-actin作为内参，采用相对定量法，以2-ΔΔCt来表示处理组VEGFmRNA的转录水平，通过溶解曲线来确认PCR反应的特异性，实验重复3次。

1.8Westernblot法检测MMP-9、HIF-1α、VEGF蛋白表达

使用RIPA裂解液提取瘤组织的总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，100 ℃变性10min后行SDS-PAGE电泳，湿转法转膜，封闭后用相应的的一抗(β-actin、MMP-9、HIF-1α、VEGF的稀释倍数均为1 ∶1 000)及二抗进行抗原抗体反应，ECL(electro-chemi-luminescent)发光法显色，曝光系统内曝光3min，观察蛋白条带的表达。

1.9免疫组化法检测MVD和Ki-67表达

CD31阳性标准和微血管计数参照文献[7]方法进行，任何被染成棕褐色的单个内皮细胞或内皮细胞团，必须与相邻的肿瘤细胞、微血管和结缔组织边界区分清楚才作为一个微血管计数，如果结构不相连，其分支结构也当做一个微血管计数，管腔面积大于8个细胞且有较厚肌层的血管不做计数，背景中阳性表达的浆细胞和血细胞等根据形态进行排除。光学显微镜下先在低倍视野下(×100)扫描整张切片，每张切片选择5个微血管密集区，然后在高倍视野下(×400)随机计数其中5个视野，取平均值列入分析。

实验步骤同前，Ki-67阳性细胞为细胞核被染成棕黄色或棕褐色的细胞，计算Ki-67阳性细胞在总细胞中的比例。计算参照文献[8]方法进行，每张切片在低倍镜(×100)下随机选取5个视野，在高倍镜(×400)下对阳性细胞进行计数，取其均数，均数/细胞总数即为结果。

1.10统计学分析

采用SPSS15.0软件进行数据分析,计量资料描述用均数±标准差表示，不同条件下组间比较采用重复测量方差分析，对计量资料和计数资料分别进行配对t检验和卡方检验, 所有的统计检验均采用双侧检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组小鼠的体重变化曲线、一般情况和死亡情况

给药前对各组小鼠的体重进行分析，差异无统计学意义，各组间具有可比性。开始给药后每2日称小鼠体重，绘制小鼠的体重曲线(图1)，发现NS组和PEG组小鼠的体重呈现先升后降的趋势，而其余3组小鼠的体重则呈现逐渐上升的趋势。相对于NS组，Rg3组和Rg3-N组小鼠的毛色更亮，精神状态更好，更加活跃，一般状况较好。实验过程中，NS、PEG、Rg3和Rg3-N组小鼠分别死亡4、3、1和2只。

2.2各组小鼠的抑瘤率和肿瘤质量与体重比值

完整剥离小鼠的肿瘤称其质量，计算各组的抑瘤率，发现PEG组、Rg3组和Rg3-N组均未表现出明显的抑瘤作用，但Rg3组和Rg3-N组的肿瘤质量与体重比值明显下降，与NS组之间差异有统计学意义(P<0.01)， 提示Rg3和Rg3纳米微粒可降低小鼠的肿瘤质量与体重比值，且Rg3-N组较Rg3组有进一步降低肿癌质量与体重比重的作用(表1)。

2.3MVD

NS、PEG-PLGA、Rg3、Rg3-N组的MVD值分别为46.3±3.8、44.5±2.6、25.0±2.2、23.7±1.5(图2)，PEG组与NS组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，提示PEG-PLGA纳米载体对MVD可能无明显影响，而Rg3组和Rg3-N组较NS组均降低，差异有统计学意义(P<0.01)，Rg3-N组较Rg3组亦有降低趋势但差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4VEGF的基因表达

PEG、Rg3和Rg3-N组VEGFmRNA的转录水平分别为NS组的92.6%、67.2%和46.1%(图3)，提示PEG-PLGA纳米载体对VEGF基因的表达可能无明显影响(P>0.05)，而Rg3和Rg3纳米微粒给药后VEGF基因的表达均下降且差异具有统计学意义(P<0.05)，且Rg3纳米微粒组相较于Rg3组其表达亦明显下降(P<0.05)。

表1　各组小鼠的肿瘤质量、体重和肿瘤质量与体重比值

C,normalcontrolgroup;NS,salinecontrolgroup;Rg3, 20(R)-ginsenosideRg3group;Rg3-N,PEG-PLGA-Rg3nanoparticlesgroup;PEG,PEG-PLGAgroup； *P<0.05, # P<0.01,comparedwithNSgroup.

C,normal control group; NS, saline control group; Rg3, 20(R)-ginseno side Rg3 group; Rg3-N, PEG-PLGA-Rg3 nanoparticles group; PEG, PEG-PLGA group.图1　各组小鼠的体重曲线Figure 1　Body weight graph of each group mice

2.5MMP-9、HIF-1α、VEGF的蛋白表达

各组的内参蛋白β-actin表达稳定(图4)，PEG组MMP-9、HIF-1α、VEGF的表达与NS组相比差别不明显，提示40mg/(kg·d)的PEG-PLGA纳米载体处理对MMP-9、HIF-1α、VEGF蛋白的表达可能无显著影响，Rg3组和Rg3-N组与NS组相比以上3种蛋白的表达下降，提示40mg/(kg·d)的Rg3和Rg3纳米微粒处理均能降低MMP-9、HIF-1α、VEGF的蛋白表达，且Rg3-N组与Rg3组相比有进一步下降的趋势。

2.6Ki-67阳性表达细胞比例

NS、PEG、Rg3、Rg3-N组Ki-67阳性表达细胞的比例分别为34.7%±4.2%、36.8%±3.5%、37.3%±1.6%、35.7%±3.2%(图5)，统计学分析表明，PEG、Rg3和Rg3-N组与生理盐水组相比，差异均无统计学意义(P>0.05)，Rg3和Rg3-N组之间差异也无统计学意义(P>0.05)。

A, NS group; B, PEG group; C, Rg3 group; D, Rg3-N group.图2　各组小鼠瘤组织 MVD表达Figure 2　MVD expression in each group mice tumor tissue

*P<0.05, compared with NS group; △P<0.05, compared with Rg3 group. 图3　各组小鼠的VEGF mRNA相对表达量Figure 3　Relative expression level of VEGF mRNA in each group mice

图4　各组小鼠瘤组织中的蛋白表达Figure 4　Protein expression in each group mice tumour tissue

A, NS group; B, PEG group; C, Rg3 group; D, Rg3-N group.图5　各组小鼠瘤组织 Ki-67表达Figure 5　Ki-67 expression in each group mice tumour tissue

3讨论

本研究Rg3和Rg3纳米微粒可以明显降低荷瘤小鼠的MVD，但却对荷瘤小鼠的肿瘤质量没有明显的影响。MVD即微血管密度，是评价肿瘤组织血管生成的常用指标，MVD降低提示肿瘤的血管生成受到抑制，肿瘤的血液供应减少，理应肿瘤缩小，但为何MVD降低的同时没有带来瘤体的缩小，针对此疑问，本研究发现尽管Rg3和Rg3-N组小鼠的绝对肿瘤质量并不低于生理盐水组，但此两组小鼠的一般状况更好，体重更大，因此本研究认为绝对肿瘤质量上的无差异是由于Rg3和Rg3纳米缓释微粒的干预可能改善了小鼠的体质，使肿瘤能获得的营养总量更多所导致，并非因为它们不具有抗肿瘤作用，它们的作用不能仅仅依据绝对的肿瘤质量来说明，而应与小鼠的整体情况结合起来综合评价。因此本研究引入了肿瘤质量与体重比值这个概念来共同说明Rg3的抗肿瘤作用，结果发现，尽管Rg3组和Rg3-N组的肿瘤质量与NS组相比没有明显差异，但二组的肿瘤质量与体重比值较NS组明显下降，提示Rg3和Rg3纳米微粒可能具有体内的抗肿瘤活性。

对于Rg3和Rg3纳米微粒降低MVD的内在机制，分子生物学的结果显示，这两组的MMP-9、HIF-1α、VEGF表达均下降。MMPs对血管生成的意义除了“打开血管生成开关”外，还体现在降解基底膜，为内皮细胞移行至血管生成部位打开通道[9]。HIF-1α、VEGF对肿瘤的血管新生乃至整体发展都具有十分重要的意义，HIF-1α作为迄今为止发现的唯一一个在特异性缺氧情况下发挥活性的转录因子，在肿瘤微环境的调控网络中处于重要地位，不但能直接促进VEGF转录，增加VEGFmRNA的稳定性，上调VEGF表达，还能诱导环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,cox-2)、核因子κB(nuclearfactorκB，NF-κB)等炎性因子表达，继而影响表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)、血小板衍生生长因子(platelet-derivedgrowthfactor，PDGF)等促血管因子来促进血管新生,以及诱导MMP表达上调而促进肿瘤血管生成和转移，影响整合素、钙黏素等肿瘤黏附分子表达而促进肿瘤血管生成和转移等[10]。VEGF是目前公认最重要的血管生成调节因子，除了最初发现的调节血管通透性的作用外，还可以诱导内皮细胞表达整合素-1、αV、β3、β5及其配体，介导内皮细胞迁移和浸润；可以诱导内皮细胞分泌多种组织蛋白酶降解细胞外基质，促进内皮细胞的增殖、迁移、运动和血管腔样结构形成；近年来还发现VEGF可以动员内皮祖细胞从骨髓进入外周血，是血管生成的主要调控因子之一。因此本课题组认为，Rg3和Rg3纳米微粒的体内抗血管活性可能来源于它们对MMP-9、HIF-1α、VEGF表达的抑制，它们除了可以通过抑制MMPs的活性来抑制内皮细胞向血管生成部位的运动外，还可以改善肿瘤局部的缺氧状况而降低VEGF的表达。

肿瘤细胞的一大特征就是失去控制的恶性增殖，其恶性增殖的水平与其恶性程度呈正相关，因此本课题组还通过免疫组织化学方法检测Ki-67，观察各组肿瘤细胞的增殖率。Ki-67是一种与细胞周期有关的增殖细胞核抗原，同细胞的DNA半保留复制具有偶连性，在有丝分裂的G1，G2，S，M期都有表达，其中以G2期和M期表达最强。Ki-67的反义寡核苷酸可以抑制细胞的增生，提示Ki-67的阳性表达与细胞增殖密切相关。本研究发现PEG、Rg3和Rg3-N组Ki-67的阳性表达率与生理盐水组相比差异均无统计学意义(P>0.05)，Rg3组和Rg3-N组之间差异也无统计学意义(P>0.05)，提示无论是PEG-PLGA纳米载体，还是Rg3单体，以及Rg3纳米缓释微粒均不能直接抑制Lewis肺癌小鼠肿瘤细胞的增殖。

综上所述，人参皂苷Rg3抗肺癌血管生成的作用不是通过直接的杀伤癌细胞或是抑制肿瘤的增殖，而是通过降低MMP-9、HIF-1α、VEGF等血管生成相关因子的表达，减少肿瘤对内皮细胞的募集,以及改善动物的一般状态来实现的，这与人参皂苷Rg3作为扶正中药人参的有效成分相符，与中医治疗癌症的原则——扶正培本治则也是相符的。Rg3纳米微粒抑制肿瘤血管生成的作用并不弱于Rg3，考虑到每毫克的纳米微粒仅载有368μg的Rg3原药，我们有理由认为Rg3的纳米化包埋提高了Rg3的抗肿瘤活性。PEG-PLGA形成的亲水/疏水二嵌段共聚物制备的纳米药物载体因其通过物理方式包载药物和不改变药物化学组分的优点近年来受到广泛关注，此外，它还具有粒径小、水溶性高、载药范围广、缓释、无毒等优点[11-12]，是肿瘤药物新剂型研究领域的热点之一。PEG-PLGA二嵌段共聚物含有亲水和疏水两部分结构，PLGA组成纳米粒的疏水内核，通过物理结合的方式包载药物，在体内可缓慢无毒降解为CO2和水，因此具有缓释作用；PEG因具有良好的生物相容性和无毒特点，常被用做纳米粒的亲水性外壳，主要用以提高纳米微粒在溶液中的稳定性。由于药物被包裹在纳米微粒的内核，因而可以长效缓慢地释放,并使那些水溶性差的药物能高效地进入机体组织[13]，从而更好地被机体利用。因此，本课题组推测经过PEG-PLGA纳米载体的包埋，Rg3在体内能够缓缓的释放，从而达到更高的生物利用度和维持更长时间的血药浓度，最终提高了Rg3的治疗效果。在后续的研究中，还需要进行相应的体内药物代谢方面的实验来提供更有力的证据支持。

[1]YuePY,WongDY,WuPK,etal.Theangiosuppressiveeffectsof20(R)-ginsenosideRg3[J].BiochemPharmacol, 2006, 72(4): 437-445.

[2]何斌, 钱立庭, 江浩. 人参皂苷Rg3对鼻咽癌放疗患者细胞免疫功能影响[J].安徽医科大学学报, 2015, 30(9): 1293-1296.

[3]XuTM,CuiMH,XinY,etal.InhibitoryeffectofginsenosideRg3onovariancancermetastasis[J].ChinMedJ(Engl), 2008, 121(15): 1394-1397.

[4]RodrigoGarzónM,TirapuFernándezdelaCuestaI,ArinaIraetaA,etal.Useofgenetherapyinasubcutaneousmurinemodeloflungcancer[J].ArchBronconeumol, 2006, 42 (10): 526-532.

[5]赵增虎, 丁瑞亮, 宁宇, 等. 参一胶囊对小细胞肺癌患者化疗后免疫功能的影响[J]. 中国急症, 2010, 19(4): 598-599.

[6]董光同, 蒋成榜, 高元兴, 等. 参一胶囊对食管癌患者血清中血管内皮细胞生长因子影响作用的研究[J]. 现代中西医结合杂志, 2008, 17(4): 509-510.

[7]HaraH,AkisueT,FujimotoT,etal.ExpressionofVEGFanditsreceptorsandangiogenesisinboneandsofttissuetumors[J].AnticancerRes, 2006, 26(6B): 4307-4311.

[8]罗小敏, 张茨, 杨嗣星, 等.Ki-67、Thy-1和Oct4在小鼠生精恢复过程中的表达及其意义[J]. 武汉大学学报: 医学版, 2009, 30(6): 720-724.

[9]刘璐, 刘思远. 肿瘤血管生成细胞与分子机制研究进展[J]. 亚太传统医药, 2011, 7(4): 165-167.

[10]BrownJM,WilsonWR.Exploitingtumourhypoxiaincancertreatment[J].NatRevCancer, 2004, 4(6): 437-447.

[11]ChengJ,TeplyBA,SherifiI,etal.FormulationoffunctionalizedPLGA-PEGnanoparticlesforin vivotargeteddrugdelivery[J].Biomaterials, 2007, 28(5): 869-876.

[12]WangZ,ChuiWK,HoPC.DesignofamultifunctionalPLGAnanoparticulatedrugdeliverysystem:evaluationofitsphysicochemicalpropertiesandanticanceractivitytomalignantcancercells[J].PharmRes, 2009, 26(5): 1162-1171.

[13]AsteteCE,SabliovCM.SynthesisandcharacterizationofPLGAnanoparticles[J].JBiomaterSciPolymEd, 2006, 17(3): 247-289.

(2015-10-22收稿)

(本文编辑：王蕾)

Preliminary study for the roles and mechanisms of 20(R)-ginsenoside Rg3 and PEG-PLGA-Rg3 nanoparticles in the Lewis lung cancer mice

GENG Liang1, FAN Jing2, GAO Qi-long1, YU Jing3, HUA Bao-jin4△

(1.DepartmentofIntegratedChineseandWestemMedicine,CancerHospitalAffiliatedtoZhengzhouUniversity,HenanCancerHospital,Zhengzhou450008,China; 2.HenanUniversityofChineseMedicine,Zhengzhou, 450008,China; 3.DepartmentofOncology,BeijingFriendshipHospitalAffiliatedtoCapitalMedicalUniversity,Beijing100050,China; 4.DepartmentofOncology,Guang’anmenHospital,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100053，China)

ABSTRACTObjective：To comparatively observe the effects of 20(R)-ginsenoside Rg3 and PEG-PLGA-Rg3 nanoparticles on the Lewis lung cancer mice and to explore the mechanisms of Rg3 and PEG-PLGA-Rg3 nanoparticle anti-cancer in vivo. Methods: Lewis lung cancer mouse model was established and 60 mice were randomly divided into 5 groups with twelve in each group: PEG-PLGA-Rg3 nanoparticles group(Rg3-N), PEG-PLGA group (PEG), Rg3 group (Rg3), normal control group(C), saline control group(NS), and received intragastric administration for 14 days. The weights of the mice were measured every 2 days and the weight curves were obtained. At the same time, the color pattern, activity and mental status were observed. The mice were sacrificed when the administration was over, and the effects of 20(R)-ginsenoside Rg3 and PEG-PLGA-Rg3 nanoparticles on tumor weight, and the tumor:weight ratios were analysed. In addition, the tumor microvessel density (MVD) was measured by immunohistochemical staining with anti-CD31 antibody to compare the effects of Rg3 and PEG-PLGA-Rg3 nanoparticles on the tumor angiogenesis in vivo. Furthermore, the levels of such angiogenesis and proliferation factors as MMP-9,HIF-1α,VEGF,Ki-67 were examined by RT-PCR, Western blot and immunohistochemistry to explore the internal molecular mechanisms of anti-tumor effects in vivo. Results: The trends of variation of the mice weights in NS group and PEG group were rising early but declining later. In contrast, the trends of the other three groups were rising early and became stable later. In comparison with NS group, the mice of Rg3 group and Rg3-N group had better general status: brighter color, more active and better spirit. Compared with NS group，the tumor weight in PEG group, Rg3 group and Rg3-N group showed no significant difference but the tumor:weight ratio and MVD in Rg3 group and Rg3-N group declined signi-ficantly (P<0.01). Besides, there was no significant difference between Rg3 group and Rg3-N group. At the same time, the level of VEGF mRNA, the protein expression of MMP-9, HIF-1α,VEGF in Rg3 group and Rg3-N group decreased compared with NS group. Furthermore, the level of each index above-mentioned in Rg3-N group was lower than that in Rg3 group. The expression of Ki-67 in PEG group,Rg3 group and Rg3-N group showed no significant difference compared with NS group. Conclusion: Rg3 and PEG-PLGA-Rg3 nanoparticle may suppress the expression of VEGF, MMP-9 and HIF-1α in Lewis lung cancer mice, thereby indirectly contributing to their antitumor effects and alleviating the mice’s general status. In addition, PEG-PLGA nanoparticles embedding can promote Rg3 antitumor effect in vivo.

KEY WORDSGinsenoside Rg3; Nanoparticles; Carcinoma, Lewis lung; Angiogenesis

基金项目：国家自然科学基金(81473638,30973839)资助Supported by the National Natural Science Foundation of China (81473638, 30973839)

[中图分类号]R734.2

[文献标志码]A

[文章编号]1671-167X(2016)03-0496-06

doi:10.3969/j.issn.1671-167X.2016.03.021

△Correspondingauthor’se-mail,huabaojin@sohu.com

网络出版时间：2016-5-1815：10：00网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4691.R.20160518.1510.002.html