冯子聪，张 昭，黎 哲，冯博仪，陈思艾，李君宇，肖小敏（.暨南大学国际学院临床医学系，广州 50000；.暨南大学附属第一医院妇产科，广州 50000）



大肠埃希菌致兔慢性输卵管炎症模型的建立

冯子聪1，张 昭2，黎 哲2，冯博仪1，陈思艾1，李君宇1，肖小敏2
（1.暨南大学国际学院临床医学系，广州 510000；2.暨南大学附属第一医院妇产科，广州 510000）

【摘要】目的 利用大肠埃希菌建立新西兰兔输卵管慢性炎症模型。方法 制备3×109/ mL的混合菌液（大肠埃希菌：金葡菌：链球菌按2∶1∶1体积混合）和3×108/ mL大肠埃希菌混悬液。18只新西兰雌兔随机分三组，其中正常组2只、混合菌液实验组8只、大肠埃希菌液实验组8只。通过经阴道宫腔插管灌注术分别将混合菌液和大肠埃希菌液注入两组实验兔体内。于菌液宫腔灌注术后第5、10、15、20天观察大体标本及光镜下输卵管炎症形成情况。结果 混合菌液组和大肠埃希菌液组兔均于灌注术第15天呈慢性输卵管炎症改变。结论 两种建模方法均具有接近人体感染途径、成模率高、操作简便的优点，是建立输卵管慢性炎症动物模型的有效方法。

【关键词】慢性输卵管炎症模型；混合菌液；大肠埃希菌液；经阴道宫腔内插管灌注术；

在进行动物实验以探讨输卵管炎症性不孕的治疗方法时，首先必须选择一种输卵管结构和功能与人类相近的动物制作相应疾病的动物模型。新西兰兔不仅其输卵管结构与人类输卵管结构相似，而且具有便于实验操作，价格便宜，饲养容易等特点，因此本研究以其为研究对象，制作输卵管慢性炎症模型。在建模效果相似的前提下，相对于混合菌液，单一菌液具有细菌用量少，配制更简便，细菌活力影响小等优点。因此，本节分别使用混合菌液与大肠埃希菌液两种方法制备新西兰兔输卵管模型，以探讨选择新西兰兔慢性输卵管炎模型建立的具体可行方法。

1　材料和方法

1.1实验动物

清洁级新西兰雌兔18只（4～5月龄，未孕，体重2. 5 kg±250 g）由广州中医药大学动物实验中心提供【SCXK（粤）2009－0023】。无菌手术在广州中医药大学动物实验中心无菌实验室进行【SYXK（粤）2013－0001】。购回后在动物实验中心饲养1周，以适应环境。18只清洁级新西兰雌兔按体重由低到高依次编号：1～18号，根据SPSS完全随机设计的分组方法将18只新西兰兔随机分3组，分别为正常组2只、混合菌液实验组8只、大肠埃希菌液实验组8只。

1.2细菌混悬液的制备

大肠埃希菌（ATCC25922）、金黄色葡萄球菌（ATCC25923）、乙型溶血性链球菌（ATCC21059），均由广州市暨南大学医学院微生物教研室提供、培养。将这三种细菌原液分别加入生理盐水稀释浓度至3×109/ mL［1］，然后大肠埃希菌：金葡菌：链球菌按2∶1∶1体积的比例混合，制备成混合细菌混悬液备用。另将大肠埃希菌3×109/ mL浓度的菌液加入生理盐水制备成3×108/ mL大肠埃希菌混悬液备用（制模用细菌悬液均为即用即配，以避免菌液浓度明显改变）。

1.3新西兰兔造模

步骤：（1）实验前6 h每只兔于后肢外侧肌肉丰富处肌内注射HCG 80国际单位［2－3］。（2）经阴道宫腔内插管灌注术：3%戊巴比妥钠溶液按1 mL/ kg予耳缘静脉注射麻醉兔后，固定并暴露外阴，将一次性无菌6号小儿吸痰管插入兔泌尿生殖口内约8～10 cm［3－4］；回抽未见液体，证明插管顺利进入宫腔。混合菌液组8只兔均予插管内灌注混合菌液（每兔按1 mL/ kg的灌液量，取3×109/ mL混合菌液1 mL加入生理盐水调至相应的灌液量）；大肠埃希菌液组8只兔则予插管内灌注大肠埃希菌液（每兔按1 mL/ kg的灌液量，取3×108/ mL大肠埃希菌液1 mL加入生理盐水调至相应的灌液量）。灌菌液后抬高兔臀静置3 min后放回饲养笼。（3）术后于第5、10、15、20天两个实验组分别随机处死2只兔，正常组兔于肌注HCG后第20天处死，取输卵管标本备检。

1.4观察项目

1.4.1肉眼观察：

输卵管外观形态改变、与周围组织器官粘连情况以及腹腔有无积液等情况。

1.4.2输卵管通畅情况观察：

距宫角约1 cm处用动脉夹夹闭子宫腔，自宫角处向输卵管方向进针，用5%亚甲蓝溶液2 mL向输卵管内注射。通畅程度判断：（1）通畅，即注射过程中无阻力，伞端见亚甲蓝液体溢出；（2）通而不畅，即注射过程中有阻力，加压后阻力减少，伞端可见亚甲蓝液体溢出；（3）不通，即注射过程中阻力大，加压后阻力无减少，伞端未见亚甲蓝液体溢出。

1.4.3盆腔粘连情况：

参考Nair等［5］制定的5级分类法，完全无粘连为0级，计0分；内脏间或内脏与腹壁间1条粘连带为Ⅰ级，计1分；内脏间或内脏与腹壁间2条粘连带为Ⅱ级，计2分；多于2条粘连带而内脏未直接粘连至腹壁为Ⅲ级，计3分；内脏直接粘连到腹壁，不管粘连带多少为Ⅳ级，计4分。

1.4.4光镜下病理改变：

观察完后，取双侧输卵管-子宫交界部，近端、远端各一段，用4%多聚甲醛固定，常规切片，HE染色，光镜下观察病理改变。

2　结果

3组兔共18只均存活，两组模型兔外观及分泌物均未见明显异常。制模过程未使用抗生素和其他药物。

2.1各组新西兰兔输卵管大体观察比较

正常组 兔盆腔未见异常。生殖器官包括阴道、双角子宫、输卵管和卵巢。输卵管外观光滑，呈粉红色，峡部管腔内径约0. 5～1 mm，壶腹部管腔内径约1～2 mm。于造模第5天，混合菌液组和大肠埃希菌液组均呈现腹膜充血、盆腔膜性粘连，腹腔积液等急性盆腔炎改变，而双侧输卵管则出现系膜血管充血，管壁水肿增粗等急性炎症反应。造模后第10天，两组模型兔均见盆腔充血，仍可见盆腔膜性粘连，盆腔积液较第5天时明显减少，输卵管系膜血管充血，管腔稍增粗、扭曲。造模后第15天，两组模型兔均见腹膜炎症充血，盆腔见少量清亮积液，腹膜粘连较第5、10天时致密，输卵管增粗、扭曲、僵硬或肿胀，内有淡黄色积液。制模第20天，两组模型兔均见腹膜炎症充血，盆腔见清亮积液，可见致密腹膜粘连，输卵管增粗、扭曲、僵硬或肿胀，内有淡黄色积液（表1）。

表1　造模不同时期输卵管通畅情况及粘连情况Tab. 1 The patency and adhesion of oviduct in different periods

2.2各组新西兰兔输卵管光镜下观察比较

正常组兔输卵管间质部，镜下可见管腔通畅，结构清晰，粘膜皱褶低矮且二级分支不明显，皱褶被覆粘膜为单层柱状上皮，上皮纤毛短小，粘膜下间质未见明显血管增生，粘膜下层间质和肌层比例约1：1（图1A）。输卵管壶腹部粘膜皱褶丰富，二级分支多，皱褶被覆粘膜为单层高柱状上皮，上皮纤毛丰富整齐，粘膜下层间质少且无明显血管增生（图1B）。于造模第5天，混合菌液组和大肠埃希菌液组模型兔输卵管均呈典型急性炎症改变：输卵管上皮坏死脱落，管腔内大量炎性细胞渗出，间质充血，管壁全层大量中性粒细胞浸润。造模第10天的病理与第5天基本相似，皆呈急性炎症改变，但间质充血减轻，中性粒细胞浸润稍减少。造模第15天，两组模型兔输卵管镜下均呈典型慢性炎症改变：输卵管间质部可见管腔狭窄，粘膜皱褶变平；粘膜下间质增生，厚度大于全层2/3，间质血管增生明显；淋巴细胞散在浸润全层（图1C，D）。输卵管壶腹部粘膜皱褶尚丰富，二级减少分支；上皮纤毛凌乱、稀疏、短小或缺如，高柱状上皮变立方上皮且胞核排列不规整；粘膜下层间质增生，间质血管增生；淋巴细胞散在或局灶浸润（图1E，F）。制模第20天两组模型兔输卵管镜下所见与第15天时相似。

3　讨 论

输卵管炎性动物模型的建立，是研究输卵管性不孕、盆腔炎症等疾病的基础。目前制作输卵管炎症阻塞动物模型的方法主要有物理、化学、生物学方法3种［6－7］。物理、化学方法包括机械夹闭损伤、电热、激光、苯酚等药物灼伤等，虽然均有大量报道能制成慢性炎症损伤输卵管的模型，但是其致炎途径和人类发生输卵管炎的途径差异很大，因此这些建模方法现在已被大部分实验摒弃。生物方法即采用细菌、沙眼衣原体、支原体等病原微生物注入输卵管内引起其炎性反应［8－10］，这种方法基本接近人类输卵管炎症感染的途径，能更真实的在动物体内还原人类输卵管炎症的实际情况，在这种成模方法下建立的输卵管炎症模型研究结果更具有说服力。

在建立输卵管炎的动物模型实验操作中，大部分学者采用开腹后将一定浓度的病原微生物混悬液直接自宫角向一侧输卵管内注射的方法［10－14］。该方法对动物的损伤大，动物接受手术后应激反应重，易加重腹盆腔感染情况及出现手术并发症、败血症等意外情况，造成动物死亡，降低成模率。申刚等［1］在数字减影血管造影（digital subtraction angiongraphy，DSA）引导下经子宫输卵管插管介入途径，将金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌和大肠埃希菌的混合菌混悬液经导管注入输卵管，建成新西兰兔输卵管慢性炎症模型。但是DSA费用昂贵，显然不能作为常规建模手段。李俊良等［3］应用金葡菌和大肠埃希菌混合菌液采用直接宫腔插管灌注的方法同样成功制备兔输卵管炎症模型。该方法试验器材简便、便宜，操作简单，对实验动物损伤小，接种细菌后动物死亡率低，因此本研究建立新西兰兔输卵管慢性炎症模型时亦采用此法。

图1　各组新西兰兔输卵管光镜下病理学改变比较Note：A. Normal interstitial part（×20）The arrow indicated simple columnar epithelium；B. Normal ampullar part（×20）The arrow indicated simple tall columnar epithelium；C. Model’s interstitial part on the 15thday（×40）（E. coli group）The arrows from left to right indicated the infiltrating lymphocyte and the proliferating vessel，respectively；D. Model’s interstitial part on the 15thday （×40）（Mixed group）The arrows from left to right indicated the infiltrating lymphocyte and the proliferating vessel，respectively；E. Model’s ampullar part on the 15thday（×40）（E. coli group）The arrows from left to right indicated the proliferating vessel and the infiltrating lymphocyte，respectively；F. Model’s ampullar part on the 15thday（×40）（Mixed group）The arrows from left to right indicated the infiltrating lymphocyte and the proliferating vessel，respectively.Fig. 1 Comparison of the pathological changes of oviducts among different groups under light microscope

在本研究中分别采用3×109/ mL的混合菌混悬液（大肠埃希菌：金葡菌：链球菌以2∶1∶1体积混合）和3×108/ mL的大肠埃希菌混悬液对新西兰雌兔进行经阴道宫腔插管灌注。两种菌液灌注后，均在第5天时光镜下观察到输卵管上皮脱落，坏死，管腔内大量炎性细胞渗出，间质充血，管壁全层大量中性粒细胞侵润等典型急性炎症的表现；在第15天时观察到输卵管管腔狭窄，粘膜皱褶减少，粘膜下间质增生，间质血管增生，淋巴细胞浸润，上皮纤毛凌乱、稀疏、短小或缺如等典型慢性炎症的表现。这与李俊良等［3］报道的输卵管炎症动物模型14 d前均为急性炎症，15 d开始出现慢性炎症至49 d完全建成慢性炎症模型相比有时间上的差别。但与申刚等［1］报道的新西兰兔输卵管炎症建模于第5天出现急性炎症，第15天出现慢性炎症相似。考虑其原因可能有：病原菌侵入机体能否致病，与细菌的毒力、侵入机体的数量、侵入门户以及机体的免疫力、环境因素等密切相关。另外各种常规实验操作和不同的饲育环境对实验动物的神经内分泌、免疫、血液生理等指标亦有不同程度的影响［15］。

对比混合菌液和大肠埃希菌液两组动物模型，在第15天时，虽然混合菌液组兔的盆腔粘连情况、镜下见淋巴细胞浸润和间质增生情况等均较大肠杆菌组兔严重，但是大肠埃希菌组兔的输卵管镜下亦能呈现典型慢性炎症的表现。且3×108/ mL的大肠埃希菌混悬液与3×109/ mL的混合菌混悬液相比具有细菌浓度低、细菌用量少、配制更简便、细菌活力受影响小等优点。但就模拟输卵管炎的混合细菌逆行感染条件而言，混合菌混悬液则更具相似性。

因此综上所述，采用3×108/ mL的大肠埃希菌混悬液或3×109/ mL的大肠埃希菌：金葡菌：链球菌以2：1：1体积混合的细菌混悬液进行经阴道宫腔插管灌注的方法均能在灌注术后第15天建立新西兰兔输卵管慢性炎症的模型。两种建模方法均具有接近人体感染途径、成模率高、操作简便的优点，是建立输卵管慢性炎症动物模型的有效方法。

参考文献：

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［15］ 刘丽.炎克宁对大鼠输卵管阻塞性不孕模型作用机理的研究［D］.黑龙江中医药大学，2004.

〔修回日期〕2015－11－12

The establishment of chronic salpingitis model of New Zealand rabbits caused by Escherichia coli

FENG Zi-cong1，ZHANG Zhao2，LI Zhe2，FENG Bo-yi1，CHEN Si-ai1，LI Jun-yu1，XIAO Xiao-min2
（1. Clinical Medicine，International School，Jinan University，Guangzhou 510000，China；2. Obstetrics and Gynecology Department，First Affiliated Hospital of Jinan University，Guangzhou 510000，China）

【Abstract】Objective To investigate the possibility of utilizing the mixed bacteria liquid and the Escherichia coli （E. coli）liquid to establish the chronic salpingitis model of New Zealand rabbits，respectively. Methods Taken as the study object，the un-pregnant New Zealand rabbits（4～5 years old）were randomly divided into three groups：the normal group，the mixed bacteria experimental group and the E. coli experimental group. The trans-vaginal intrauterine intubation operation was performed for the injection of the mixed bacteria liquid and the E. coli liquid. Visual observation was to evaluate the gross pathological changes of the salpingitis and the pelvic cavity. HE staining and the light microscope were used to observe the micro-pathological changes of salpingitis. Results On the 15thday after modeling，increased pelvic effusion，dense peritoneal adhesion，interstitial hyperplasia and infiltration of lymphocytes were observed in both experimental groups. Conclusion Through the trans-vaginal intrauterine intubation operation，the chronic salpingitis model of New Zealand rabbits could be successfully established either by using the mixed bacteria liquid or by using the E. coli liquid.

【Key words】Chronic salpingitis model；Mixed bacteria liquid；E. coli liquid；Trans-vaginal intrauterine intubation operation

【中图分类号】Q-31 R-332

【文献标识码】A

【文章编号】1671-7856（2016）03-0019-05

doi：10. 3969. j. issn. 1671－7856. 2016. 03. 005

［基金项目］国家自然科学基金项目（81370676）；暨南大学国家级大学生创新项目（201310559069）；广东省科技计划项目（2012B32000007）；广州市科技计划项目（7411785665675）。

［作者简介］冯子聪（1992－），男，本科生，研究方向：妇产科学；张昭（1984－），女，主治医师，博士，研究方向：妇产科学。两者为共同第一作者。

［通讯作者］肖小敏（1962－），女，教授，博士，研究方向：围产医学。