李小平，郝朝亮，郭　辉

(1.南华大学附属第一医院生殖医学中心，湖南衡阳 421001；2．中南大学医学遗传学国家重点实验室，湖南长沙 410078)



Shank3基因多态性与汉族儿童孤独症的病例对照研究*

李小平1，郝朝亮1，郭辉2

(1.南华大学附属第一医院生殖医学中心，湖南衡阳 421001；2．中南大学医学遗传学国家重点实验室，湖南长沙 410078)

[摘要]目的探讨Shank3基因的单核苷酸多态性(SNPs)与汉族儿童孤独症的相关性。方法采用Illumina CNV 370-Duo芯片和Illumina 610芯片对455例孤独症患者(孤独症组)和1 097例无孤独症及相关精神疾病儿童(对照组)的Shank3基因SNPs位点进行基因分型检测，对基因分型数据采用haploview4.1软件进行关联分析。结果Shank3基因的rs736334、rs8137951位点的等位基因频率和rs9616816-rs736334的G-G、A-A及rs715586-rs8137951的G-A单体型频率在两组间的传递比较，差异有统计学意义(P<0.05)，但经1 000次模拟置换检验后的结果比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结论Shank3基因与汉族儿童孤独症的致病不存在相关性，Shank3基因可能不是汉族儿童孤独症的易感基因。

[关键词]Shank3基因；多态性，单核苷酸；病例对照研究

孤独症是一种广泛发育障碍性疾病，其主要临床特征为语言交流障碍，刻板的行为模式和兴趣狭窄[1]。孤独症的病因复杂，且具有明显的多基因病的特点，其病因至今未明，其遗传力高达90%[2]。Shank3基因是SHANK突触骨架蛋白的一员，Shank3的结合结构域与多种膜蛋白和胞质蛋白相互作用，在神经树突成熟、功能性突触的形成及突触的功能发挥中具有重要的作用[3-5]。有文献报道在自闭症谱系障碍(autism spectrum disorder，ASD)患者中发现了Shank3基因的点突变和基因拷贝数变异，Shank3基因单倍剂量不足患者表现出孤独症的相关症状[6-9]。已有研究提示，Shank3基因与孤独症的致病可能相关，作者对该基因与汉族儿童孤独症的相关性进行研究，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料选择2008年1月至2009年12月中南大学医学遗传学国家重点实验室遗传门诊、中南大学湘雅二医院精神卫生研究所精神卫生门诊和青岛以琳培训中心收治的汉族孤独症儿童共455例(孤独症组)，其中男365例，女90例；年龄3～10岁，平均(5.12±1.23)岁。455例孤独症患儿诊断均符合DSM-IV标准和国际疾病分类诊断标准，并排除脆性X染色体综合征、染色体畸变及由于药物或神经疾病导致的与孤独症症状相似的疾病。选择同期中南大学医学遗传学国家重点实验室遗传门诊无孤独症及相关的精神疾病，无脑发育异常、精神或重大躯体疾病的汉族儿童共1 097例，其中男 876例，女221 例；年龄3～10岁，平均(5.24±1.36)岁。两组研究对象的父母或监护人对本研究均知情同意并签署知情同意书。两组儿童性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1基因组DNA 提取采集研究对象静脉血 3 mL，常规氯仿-饱和酚白细胞提取法提取 DNA，置于-80 ℃ 冰箱保存。

1.2.2基因分型采用Illumina CNV 370-Duo芯片和Illumina 610芯片检测所有样本的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)位点的等位基因型，获取Shank3基因的6个SNPs位点：即rs9616816、rs736334、rs2040487、rs6009951、rs715586、rs8137951的基因分型数据。

1.3统计学处理应用SPSS18.0软件进行统计学分析。两组间的年龄比较采用t检验。哈德温伯格遗传平衡吻合度检验、等位基因频率及单体型频率比较采用χ2检验进行，检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。应用haploview 4.1分析软件对Shank3基因的6个SNPs位点的基因分型数据进行连锁不平衡和单体型分析。

2结果

2.1哈德温伯格遗传平衡检验采用Haploview 4.1软件对两组对象的Shank3基因分型结果进行哈德温伯格遗传平衡检验，Shank3基因的6个SNPs分型的基因型频率分布均未偏离哈德温伯格平衡(P>0.05)，见表1。

表1　Shank3基因分型结果的哈德温伯格平衡检验

2.2Shank3基因SNPs的配对连锁不平衡检测与病例对照关联分析采用Haploview 4.1软件对Shank3基因的6个SNPs进行连锁不平衡检验，见表2。病例对照关联分析结果显示，rs736334、rs8137951位点在病例对照间传递与未传递的等位基因比较，差异有统计学意义(P<0.05)，但经1 000次模拟置换检验后的结果比较，差异无统计学意义(P>0.05)。Shank3基因的6个SNPs的病例对照分析结果，见表3。

表2　Shank3基因的6个SNPs的配对连锁不平衡D′值

-：此项无数据。

表3　Shank3基因6个SNPs位点病例对照分析结果

2.3Shank3基因病例对照单体型分析Shank3基因病例对照单体型分析结果显示，rs9616816-rs736334的G-G、A-A单体型及rs715586-rs8137951的G-A单体型在病例对照间的传递比较，差异有统计学意义(P<0.05)，但经1 000次模拟置换检验后的结果比较，差异无统计学意义(P>0.05)，单体型分析结果，见表4。

表4　Shank3基因病例对照单体型分析结果

3讨论

Shank3是重要的突触后致密结构骨架蛋白，是构建突触后密度复合体的主要成员，在神经信号的传递中起桥梁作用，并在突触的装配及树突的形成和成熟中起了重要作用。Shank3基因与突触的结构和功能相关，与语言发育相关[3-6]。已有研究报道了在部分孤独症患者中Shank3基因存在突变，而在对照中则没有发现该基因的突变[7-8]。且在鼠模型中对Shank3基因进行的功能研究显示Shank3基因可能与孤独症的致病相关[10-11]。以上研究结果提示，Shank3基因可能是孤独症的一个重要的候选基因，但关于该基因的多态性与孤独症的相关性研究在不同人群中的研究结果并不一致。

本研究结果显示，在未经置换检验前，Shank3基因单核苷酸多肽性位点rs736334、rs8137951的等位基因频率，rs9616816-rs736334的G-G、A-A单体型频率和rs715586-rs8137951的G-A单体型频率在孤独症的病例对照间的传递差异有统计学意义(P<0.05)，但经1 000次模拟置换检验后，差异无统计学意义(P>0.05)。尽管对Shank3基因功能研究的结果提示该基因可能参与孤独症的致病，且在部分孤独症样本中发现了该基因的点突变和CNVs的变异，以上研究均提示Shank3基因可能与孤独症的致病相关。但本研究在汉族人群中未发现所研究的6个SNPs与孤独症存在相关性。本研究所选择的SNPs位点与Qin等[12]研究所选择的位点不同，但二者在汉族人群中的研究结果具有一致性。导致各研究结果不一致的可能原因有：(1)基因型分布在不同种族中存在差异，不同种族的孤独症致病基因存在差异。(2)由于孤独症的高度异质性，尽管在孤独症的患者中发现了Shank3基因的突变，但其所占的比例少，本研究样本中可能存在该种变异的样本少，Shank3基因可能不是孤独症致病的主效基因。此外，本研究样本只纳入了典型孤独症的患儿，不包括非典型孤独症患者、阿斯伯格综合征患者，样本的差异可能导致研究结果不一致。

本研究结果提示，在汉族人群中Shank3基因可能不是汉族人群孤独症的致病基因，至少不是其致病的主效基因。然而，本研究结果的准确性可能受到以下原因的影响。(1)采用病例对照研究方法本身受到人群分层的影响，可能导致本研究结果出现偏差。(2)研究样本量的限制可能导致微效基因效应不能检出。(3)可能Shank3基因的表观遗传修饰在孤独症的致病中起了作用，而本研究不能检出。基于以上原因，有必要进一步扩大样本量对该基因进行家系为基础的关联研究和表观遗传方面的研究。

参考文献

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A case-control study on Shank3 gene polymorphism and autism in Han children*

LiXiaoping1,HaoChaoliang1,GuoHui2

(1.ReproductiveMedicineCenter,FirstAffiliatedHospital,SouthChinaUniversity,Hengyang,Hunan421001,China;2.StateKeyLaboratoryofMedicalGenetics,CentralSouthUniversity,Changsha,Hunan410078,China)

[Abstract]ObjectiveTo study the correlation between the single nucleotide polymorphisms(SNPs) of Shank3 gene with autism in the Han children.MethodsThe SNPs loci of Shank3 gene in 455 Han autistic children(autism group)and 1 097 Han children with no autism and related mental illness(control group) were detected by using Illumina CNV 370-Duo and Illumina 610 chips,the genotyping data were performed the association analysis by using the haploview4.1 software.ResultsThe transmission of allelic frequency of rs736334 and rs8137951 in Shank3 gene and the haplotype frequencies of G-G,A-A in rs9616816-rs736334 and G-A in rs715586-rs8137951 had statistically significant difference between the autism group and the control group (P<0.05),but after the replacement of 1 000 times of simulation test,the results was no longer statistically significant(P>0.05).ConclusionShank3 gene has no correlation with the pathogenesis of autism in the Han children.The Shank3 gene may not be the pathogenic gene of autism in Han children.

[Key words]Shank3 gene;polymorphism,single nucleotide;case-control study

doi:论著·临床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.04.013

*基金项目：湖南省卫生厅资助项目(B2011-067)。

作者简介：李小平(1975-)，助理研究员，博士研究生，主要从事人类疾病遗传致病机制方面的研究。

[中图分类号]R729

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)04-0469-03

(收稿日期：2015-07-02修回日期：2015-10-24)