陈金飚，颜醒愚

(福建医科大学附属第二医院泌尿外科，福建泉州 362000)



saRNA上调人前列腺癌PC-3细胞中Numb基因表达的研究*

陈金飚，颜醒愚△

(福建医科大学附属第二医院泌尿外科，福建泉州 362000)

[摘要]目的基于小激活RNA(saRNA)的肿瘤治疗策略，筛选具有激活Numb基因功能并相对高效的saRNA分子。方法设计与合成针对Numb基因的3对候选小分子双链RNA(dsRNA)分子，对照组dsRNA(dsControl)设计成与人类基因组序列非同源。将dsRNA分子转染人前列腺癌细胞(PC-3细胞)。采用RT-qPCR法检测转染后PC-3细胞中靶基因Numb的mRNA表达水平。Western blot验证转染后PC-3细胞靶基因Numb的蛋白表达水平。结果dsNumb-870、dsNumb-948均未能上调PC-3细胞中靶基因Numb mRNA和蛋白水平；而dsNumb-298能上调细胞内Numb mRNA和蛋白水平。结论dsNumb-298具有特异性激活PC-3细胞中Numb基因表达的功能。

[关键词]小激活RNA；Numb；人前列腺癌PC-3细胞

前列腺癌(prostate cancer，PCA)是一种严重威胁老年男性健康的常见泌尿系恶性肿瘤。晚期PCA患者一般经过18～20个月的内分泌治疗，由雄激素依赖性PCA(androgen-dependent prostate cancer，ADPC)转化为去势抵抗性PCA(castration-resistant prostate cancer，CRPC)，且往往伴随着骨转移的发生[1-2]。目前临床上对CRPC尚无切实有效的治疗方法。

Numb基因作为细胞命运决定因子[3]，参与细胞生长与分化的调控。Numb蛋白除了能发挥抑癌作用[4-6]外，相关文献也报道了Numb对多种正常细胞和肿瘤细胞具有诱导分化作用[4,7-11]。随着小激活RNA(small activating RNA，saRNA)发挥激活RNA(RNAa)作用的发现[12-13]，应用saRNA上调肿瘤中相关基因的表达成为肿瘤基因治疗的研究热点。

本课题组前期研究发现，Numb蛋白在PCA中的表达显著低于良性前列腺增生标本[14]，因此，本研究推测PCA发生与转变过程与Numb的表达下调密切相关。应用saRNA激活Numb基因，可能诱导CRPC细胞的分化并恢复对激素的敏感性，为PCA的治疗开辟新篇章。本研究中，首先利用已有文献提供的saRNA的设计规则，设计并合成3对靶向Numb基因启动子的候选小分子双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)分子，然后筛选出具有激活功能并相对高效的功能性saRNA分子。

1材料与方法

1.1材料化学合成3对靶向Numb基因启动子的候选dsRNA分子和dsControl购自广州伯信生物科技有限公司。人前列腺癌细胞(PC-3细胞)购自中国科学院细胞库。PC-3细胞属于CRPC。DMEM/HIGH GLUCOSE培养液、胎牛血清购自美国HyClone公司，EndoFectinTM-Lenti转染试剂购自美国GeneCopoeia公司，Trizol购自美国Invitrogen公司，miScript Reverse Transcription Kit、miScript SYBR Green PCR Kit购自德国Qiagen公司，全蛋白提取试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司，Anti-Numb购自美国Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶(HRP)羊抗鼠、HRP羊抗鼠购自BOSTER公司，BeyoECL Plus(超敏ECL化学发光试剂盒)购自碧云天生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1dsRNA的设计dsNumb-298、dsNumb-870、dsNumb-948分别为针对Numb基因启动子区相对转录起始点-298、-870、-948附近设计的与该段启动子互补配对，长度为21个核苷酸碱基对的dsRNA分子。对照组dsRNA(dsControl)与已知人基因组序列非同源，长度同样为21个核苷酸碱基对的dsRNA序列。

1.2.2细胞的培养与转染PC-3细胞生长在含10%胎牛血清的DMEM培养液，37 ℃、5%CO2培养箱培养。实验分为3组：空白组、对照组(转染dsControl)和实验组(转染候选dsRNA)。用转染试剂将dsNumb-298、dsNumb-870、dsNumb-948、dsControl分别转染入PC-3细胞。转染时细胞汇合度控制约为80%，将EndoFectin-Lenti、dsRNAs、无血清DMEM平衡至室温；用无血清DMEM培养液稀释适量dsRNAs，用同样的培养液稀释EndoFectin-Lenti试剂；轻轻涡旋dsRNA溶液，并逐滴添加稀释的EndoFectin-Lenti试剂，充分混匀后，室温静置 20 min以形成 RNA-EndoFectin-Lenti复合物；将RNA-EndoFectin-Lenti复合物逐滴加入培养板中，边加边摇晃；并使得每个实验组的dsRNA终浓度为100、50、30 nmol/L。

1.2.3总RNA的提取及RT-qPCR分析转染48 h后收集细胞用于Numb mRNA表达的分析。总RNA的提取使用Trizol试剂，每个RNA的样本用DNA酶处理以去除残余的DNA。逆转录步骤参考TaKaRa PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (D6210A)试剂盒说明书。合成的cDNA利用实时荧光定量PCR试剂及特异性引物通过qPCR进行扩增。引物序列：Numb上游5′-TCA GCA GAT GGA CTC AGA GTT-3′，下游5′-AGG CTC TAT CAA AGT TCC TGT CT-3′；GAPDH上游5′-AAC GGA TTT GGT CGT ATT GGG-3′，下游5′-CCT GGA AGA TGG TGA TGG GAT-3′。反应体系的配制及反应参数，参考TaKaRa SYBRTMPremix Ex TaqTMⅡ (Perfect Real Time)试剂盒说明进行。运用Bio-Rad CFX96Real Time PCR仪配套的Bio-Rad CFX Manager Software1.6数据分析软件进行分析。以GADPH为内参对Numb进行相对定量。采用2-ΔΔCt法来计算，表达量以倍数表示。

1.2.4Western blot检测dsRNA转染细胞72 h后收集细胞用于蛋白表达的分析，并加入PBS清洗细胞3次，加入10倍体积的裂解液(含苯甲基磺酰氟 PMSF)，冰上裂解30 min;4 ℃ 12 000 r/min，离心15 min收集上清液。考马斯亮蓝G250测定蛋白质溶液的OD值，调整样品的蛋白浓度，使各个样品的浓度在同一水平4 μg/uL。每个样本提取的蛋白上样40 μg进行不连续系统蛋白质十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，蛋白转膜后，加入5%脱脂奶粉封闭液封闭1 h后，参考一抗说明书，按1∶200(Numb)比例稀释一抗；将PVDF膜分别放入含各自一抗溶液中，4 ℃孵育一抗过夜。继而参考二抗说明书，按照1∶5 000比例稀释HRP标记的二抗。将PVDF膜加入稀释好的二抗，室温摇动孵育1 h；使用BeyoECLPlus化学发光试剂观察免疫反应条带。

2结果

2.1dsRNA的设计(1)利用Genebank数据库，找到Numb基因启动子区序列。调控区域序列(选择启动子上游200～1 200 bp的序列作为设计dsRNA的模板：Sequence ID∶ref|NC_000014.9|的73459139 to 73460138)，见图1。(2) 各个基因候选dsRNA序列如下，数字代表序列相对于转录起始点的位置，见图2。

图1　Numb基因启动子区序列及候选dsRNA靶点

图2　Numb基因各个候选dsRNA的序列及位置

1：对照组；2：30 nmol/L组；3：50 nmol/L组；4：100 nmol/L组；5：空白组；a：P<0.05，与对照组比较。

图3dsNumb-298、dsNumb-870及dsNumb-948转染PC-3细胞48 h后mRNA表达量

2.2dsRNA对CRPC PC-3细胞靶基因Numb mRNA水平的影响为了明确所设计的dsRNA是否具有激活靶基因的作用，本研究通过RT-qPCR法检测不同dsRNA转染后靶基因Numb mRNA的表达水平。根据靶基因表达水平筛选出功能性saRNA。将“功能性saRNA”定义为使靶基因mRNA表达量增加至少2倍(RT-qPCR法)。将dsNumb-298、dsNumb-870、dsNumb-948分别以30、50、100 nmol/L的浓度转染PC-3细胞48 h后，收集细胞进行qRT-PCR检测。dsNumb-298中30、50、100 nmol/L 3个浓度组Numb mRNA的表达水平较对照组显著升高(P<0.05)，其中50 nmol/L组为对照组的3倍以上。dsNumb-870、dsNumb-948中30 nmol/L组Numb mRNA的表达水平与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，但其相对表达量仅为对照组的0.67；50 nmol/L组、100 nmol/L组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

2.3dsRNA对CRPC PC-3细胞靶基因Numb 蛋白质水平的影响通过RT-qPCR检测表明，dsNumb-298可以上调Numb mRNA的表达，为明确其是否也可以上调Numb蛋白的表达，本研究将dsNumb-298转染入PC-3细胞，并通过Western blot检测转染72 h后各组细胞内Numb蛋白表达情况。结果表明， 对照组Numb蛋白相对表达量为0.386，dsNumb-298组为0.910，空白组为0.253(数据为Numb/GAPDH比值，来源于3次独立实验的平均值)，dsNumb-298组Numb蛋白表达水平较对照组显著升高(P<0.05)，为对照组的2倍以上，见图4。

图4　dsNumb-298上调PC-3细胞内Numb

3讨论

内分泌治疗方式为中国PCA患者的主要治疗方法[15]。但一般经过18～20个月，ADPC将转化为CRPC，目前临床上对CRPC尚无切实有效的方法来治疗，成为泌尿外科领域研究重点。2006年Li等[12]意外发现dsRNA上调了目的基因的表达，并把此现象命名为RNA引起的基因激活(RNAa)。dsRNA是通过靶向特定基因启动子区或反义转录本可以介导相应基因转录水平的激活[12,16]，从而上调mRNA的表达水平，发挥着与RNAi相反的作用。抑制癌基因的高表达或恢复并增强抑癌基因的低表达从而达到抑制肿瘤细胞生长目的是肿瘤基因治疗的一种重要选择。Chen等[17]使用dsp21-322在膀胱癌细胞中成功诱导了p21的基因上调,并发现上调的p21可以发挥抗肿瘤作用。

有研究表明，Numb基因是通过不对称分裂和促进细胞分化来决定细胞命运，因此被称为细胞命运决定因子[3]。相关研究表明，在人类神经胶质瘤、乳腺癌和肝癌细胞中Numb基因的表达下调[18-20]。此外，有研究发现约50%的乳腺癌患者出现Numb表达下调或丢失，丧失了对Notch的负性调控是诱发乳腺癌的重要原因[5]。Colaluca等[6]对Numb的抑癌作用作出了新的解释，证实Numb可以调控抑癌基因P53的活性。

以上说明了Numb基因可能发挥抑癌基因的作用。Numb基因在正常细胞和肿瘤细胞的分化中亦发挥着及其重要的作用。如近年来，Di Marcotullio等[4]发现Numb也可以抑制hedgehog转录因子Glil从而抑制髓母细胞瘤的生长并促进髓母细胞瘤的分化。刘伟等[8]研究表明，Numb的上调可以促进肾小管上皮细胞发生转分化。大多数患者就诊时已经是中晚期PCA，失去了早期行根治性前列腺切除术的机会，而采用内分泌治疗方式[16]。最终大多发展的CRPC，目前仍继续采用雄激素抑制治疗[16]。因此，CRPC患者的肿瘤标本较ADPC患者难以获得，亦较难进行CRPC中Numb蛋白表达水平及与ADPC比较的相关研究。国内外文献也未查找到相关研究。但本课题组前期研究发现，Numb蛋白在PCA中的表达显著低于良性前列腺增生标本[14]，因此，本研究推测PCA发生与转变过程与Numb的表达下调密切相关。

本研究发现，dsNumb-298不同浓度组与对照组比较均差异有统计学意义(P<0.05)，且Numb mRNA的相对表达量为对照组的2倍以上。通过Western blot检测发现，与对照组比较，dsNumb-298组细胞内Numb蛋白的表达显著增加(P<0.05)，为对照组的2倍以上。表明dsNumb-298为功能性saRNA，具有特异性激活PC-3细胞中Numb基因的功能。

PC-3细胞属于CRPC细胞，通过上调该细胞中Numb基因的表达，将对今后进一步研究抑制PCA细胞生长，或是诱导CRPC细胞向ADPC细胞转化，恢复对激素的依赖性，在基因水平上寻求治疗中晚期PCA的新方法奠定了理论和实践基础。是否存在对Numb基因激活效果比dsNumb-298更好的dsRNA？dsRNA发挥作用，除了靶向启动子不同区域外，是否与局部染色质结构等微环境的影响有关？激活Numb基因表达后，是否能诱导PC-3细胞的分化？针对这些问题的研究，成为今后通过saRNA激活靶基因，治疗肿瘤等疾病的难题。因此，进一步研究dsRNA发挥激活作用的机制，进一步发现更高效的功能性saRNA，从而更好地对中晚期PCA进行更高效的基因治疗。

综上所述，dsNumb-298为筛选出的功能性saRNA，能上调细胞内Numb mRNA和蛋白水平，具有特异性激活人前列腺癌细胞株中Numb基因的功能。

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Study on saRNA′ s upregulation of Numb gene expression in human prostate carcinoma PC-3 cells*

ChenJinbiao,YanXingyu△

(DepartmentofUrology,theSecondAffiliatedHospital,FujianMedicalUniversity,Quanzhou,Fujian362000,China)

[Abstract]ObjectiveTo screen the relatively high efficiency small activating RNA (saRNA) molecule possessing activating the target gene Numb based on the tumor treatment strategy of saRNA.MethodsThree pairs of candidate small double-stranded RNA (dsRNA) molecules were designed and synthesized for target gene Numb,and the dsRNA in the control group(dsControl) was designed to be non-homologous with the human genome sequence.The dsRNA molecules were transfected into prostate carcinoma PC-3 cells.The real-time quantitative PCR (RT-qPCR) was employed to detect the mRNA expression levels of the target gene Numb in PC-3 cells after transfection.Then Western blot was used to verify the protein expression levels of the target gene Numb in PC-3 cells after transfecting the saRNA into the cells.ResultsdsNumb-870 and dsNumb-948 failed to up-regulate both the mRNA and protein expression levels of the target gene Numb in human prostate carcinoma PC-3 cells,while dsNumb-298 was succeed to elevate them significantly.ConclusionThe dsNumb-298 molecule has the function to specially activate the gene Numb expression in human prostate carcinoma PC-3 cells.

[Key words]small activating RNA;Numb;human prostate carcinoma PC-3 cells

doi:·论著·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.04.003

*基金项目：福建省自然科学基金资助项目(2012J01334)。

作者简介：陈金飚(1989-)，在读硕士研究生，主要从事泌尿系肿瘤研究。△通讯作者，Tel：15392221355；E-mail：18101908821@163.com。

[中图分类号]R737.25

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)04-0439-03

(收稿日期：2015-08-08修回日期：2015-11-10)