周 莹, 孙梨宗, 刘志红, 台培东, 李玥莹

(1. 沈阳师范大学 生命科学学院, 沈阳 110034;2. 中国科学院 沈阳应用生态研究所, 沈阳 110034)



氨氮对斑马鱼3种酶活性和基因表达的影响

周 莹1, 孙梨宗2, 刘志红2, 台培东2, 李玥莹1

(1. 沈阳师范大学 生命科学学院, 沈阳 110034;2. 中国科学院 沈阳应用生态研究所, 沈阳 110034)

目的:从酶活性测定和酶基因表达两方面探讨氨氮对斑马鱼的毒性效应,为快速准确评价氨氮水环境质量提供理论依据。方法:以斑马鱼为受试生物,研究氨氮对其毒性效应,分别在第3 d和第14 d测定斑马鱼肝脏组织SOD和AChE酶活性变化,进一步运用半定量RT-PCR测定AChE、SOD以及CYP450基因相对转录量。结论:氨氮对斑马鱼96 h-LC50为86.36 mg·L-1;SOD和AChE酶活性在暴露3 d时变化均不显著,暴露14 d时前者表现为低浓度促进高浓度抑制的趋势,后者始终处于抑制状态,且具明显的剂量-效应关系;与酶活性测定相比,相应基因(SOD、CYP450和AChE)在转录水平上的变化出现更早,更灵敏,用于氨氮污染检测更具有时效性。

氨氮; 斑马鱼; SOD; AChE; CYP450

0 引 言

《2014年中国环境状况公报》显示,我国废水中氨氮排放总量达238.5万吨,被列为废水第2大污染物。水中氨氮严重超标导致水质恶化,对鱼类等水生生物造成损伤[1],甚至还会给人体健康带来威胁[2]。

生物体在面对环境污染物刺激时会做出相应调控,这种调控首先体现在核酸水平。近年来,国内外学者就氨氮对鱼类的影响进行了大量的报道[3-5],然这些研究主要集中在生长和成活等一般综合性指标,对短时间低浓度氨氮暴露下鱼体内一些重要酶的活性,尤其是在转录水平上的研究仍较少[6]。

斑马鱼(Danio rerio),鲤科短鱼丹属淡水鱼,作为一种模式生物,其在基因、胚胎等研究领域得到了广泛的应用[7-8]。本研究以斑马鱼为实验动物,研究不同浓度氨氮暴露下斑马鱼肝脏组织SOD和AChE酶活性的变化,进一步运用半定量RT-PCR测定AChE、SOD以及CYP450基因的相对转录量,探讨氨氮对斑马鱼的毒性效应,为制定氨氮水环境监测标准提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

斑马鱼(Danio rerio)购于上海佳誉水族馆,雌雄兼有,平均体长(2.4±0.18)cm,平均体重(0.18±0.03)g,实验前在实验室驯养7 d,采用曝气自来水,水温(25±2)℃,水质条件:pH=7.5±0.3,溶解氧高于7.0 mg·L-1,每日光照12～14 h,早晚定时投喂饲料,及时处理排泄物,自然死亡率<3%。实验前24 h停止喂食,挑选强壮个体用于毒性实验。

氨氮储备液:称取38.19 g氯化铵(分析纯)用曝气纯净水稀释至1 L,制成10 g·L-1的储备液。

1.2 实验方法

1.2.1 急性毒性实验

试验方法参照国标GB/T 13267—91。

1.2.2 慢性毒性实验

以96 h-LC50为基准,设置0.1×LC50、0.4×LC50和0.8×LC50这3个处理组浓度,每个浓度3个平行,并设置空白对照(曝气纯净水),进行慢性毒性实验。在暴露初期(第3 d)和暴露后期(第14 d)分别从每个处理中取10条活鱼冰冻处死、解剖,取其肝脏组织,提取RNA,通过RT-PCR后半定量测定。

1.2.3 超氧化物歧化酶、乙酰胆碱酯酶活性测定

苏州科铭生物技术有限公司超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)(GY1)和乙酰胆碱酯酶(Acetylcholine Esterase, AChE)(KW1)试剂盒。

1.2.4 半定量反转录-聚合酶链反应

使用RNA提取试剂盒(BS88133,生工生物)进行RNA提取,蛋白核酸测定仪(Eppendorf)测定RNA的浓度和纯度,cDNA合成试剂盒(6110A,TaKaRa)合成cDNA。PCR扩增所用的基因序列来源于GeneBank,引物序列如下:β-actin(内参基因):F-cctgatgaagatcctgaccg,R-atccagacggagtatttgcg;SOD:F-ggccttactccaggaaaac,R-gagatgtaattgtcagcgg;AChE:F-ttgctcttgcccactgtgctacta,R-cttcactcatcactctgttggggttc;CYP450:F-cgaaaatcccagacgggctac,R-ccctcattactgatgtgctcctct。PCR反应程序:94 ℃变性5 min;94 ℃变性30 s,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,32个循环;72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。取5 μL PCR产物电泳检测,Image Lab软件分析条带荧光强度。

1.3 统计分析

急性毒性数据采用Probit法分析,慢性毒性数据采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。以上分析由统计软件SPSS19.0完成(各图中*:p<0.05、**:p<0.01)。

2 结果与分析

2.1 急性毒性实验

通过急性毒性实验得到氨氮对斑马鱼24,48,72和96 h的LC50分别为126.22、104.74、102.87和86.36 mg·L-1(见表1)。观察发现,高浓度氨氮胁迫下,斑马鱼个体行动明显迟缓,且排泄物较多。

表1 氨氮对斑马鱼的半致死浓度

2.2 氨氮暴露对斑马鱼SOD、AChE酶活性影响

氨氮对斑马鱼SOD和AChE酶活性的影响结果见图1。由图1(a),氨氮暴露初期(第3 d),各实验组SOD活性与对照组无显著差异,暴露后期(第14 d),各浓度组差异显著:与对照组相比,低(0.1LC50)和中浓度组(0.4LC50)SOD酶活性增加了12.23%和16.47%,而高浓度组(0.8LC50)SOD酶活性降低了19.30%;由图1(b),氨氮暴露初期和暴露后期,AChE酶活性均受到抑制,随暴露时间的增加,暴露浓度越高,AChE活性被抑制的效果越明显,与对照组相比酶活降低分别达12.32%,22.45%和25.36%。

2.3 氨氮对斑马鱼基因相对转录量的影响

图2(a)是β-actin(内参基因)、SOD、CYP450和AChE基因RT-PCR电泳结果,可知,SOD和CYP450条带亮度差异显著。经扫描分析,氨氮胁迫第3 d,SOD基因相对转录量随氨氮浓度表现为先降低后升高的趋势,各处理间差异显著,与酶活测定相比,氨氮对基因转录的影响更早;染毒第14 d,高浓度组(0.8LC50)表现出明显的抑制作用,其整体变化趋势为先升高后降低,与酶活测定结果基本一致。CYP450基因的转录在初期和后期均明显受到抑制,各处理间基因相对表达量具有显著差异。

图1 氨氮对斑马鱼肝脏组织SOD(a)和AChE(b)酶活性影响

3 讨 论

通过急性毒性实验得到氨氮对斑马鱼96 h-LC50为86.36 mg·L-1,与其他已有报道的鱼类氨氮毒性值比较,如氨氮对白斑狗鱼成鱼、黄颡鱼、麦穗鱼的96 h-LC50分别为24.92、148.1、247.35 mg·L-1等[9],发现氨氮对斑马鱼的毒性与对其他不同鱼类的毒性大小存在一定的差距,这说明不同生物对氨氮毒性的抵抗能力存在差异。

SOD作为鱼体中重要的抗氧化性酶,当受到外界污染环境刺激时,其自身活性发生变化[10]。本研究中,斑马鱼肝脏组织中SOD酶活性在长时间的氨氮胁迫下呈现先升高后降低的现象,这与其他一些报道类似[11-12]。乙酰胆碱酯酶(AChE)是目前研究的最广泛、最成熟的生物标志物(biomarker)之一,可用于对自然环境中极低浓度污染物的检测[13]。本研究发现,不同染毒时间和不同染毒浓度的处理下,AChE酶活性均受到抑制,然而处理之间差异却不显著,与AChE基因相对表达量测定结果不一致。细胞色素P450(CYP450)属于诱导酶,其降解有毒物质的能力受基因表达调控、翻译后修饰等影响[14]。研究发现与酶活测定相比,氨氮对基因(SOD、CYP450)转录的影响更早,胁迫后期的变化趋势与酶活测定结果基本一致。这充分说明斑马鱼酶活性以及相应基因转录水平上的变化能够作为生物标记物有效的监测氨氮对水体环境的污染,且后者更具时效性。

4 结 论

本研究检测了氨氮对斑马鱼肝脏组织AChE和SOD酶活性的影响,并在基因转录水平分析了氨氮对相应基因相对表达的效应。结果显示,与酶活性测定相比,相应基因(SOD和CYP450)在转录水平上的变化出现更早,更灵敏。利用污染物浓度与酶蛋白基因表达水平的定量关系能够快速有效的诊断环境污染变化对生物体造成的损伤,以便对环境污染做出早期预警。

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Effect of activity and gene expression of three enzymes on Zebrafish(Daniorerio) stressed by ammonia nitrogen

ZHOUYing1,SUNLizong2,LIUZhihong2,TAIPeidong2,LIYueying1

(1. College of Life Science, Shenyang Normal Unicersity, Shenyang 110034, China;2. Institute of Applied Ecology, Chinese Academy of Sciences, Shenyang 110034, China)

Objective: In order to provide a theoretical basis for the rapid and accurate evaluation of ammonia in water environment, the toxic effect of ammonia to zebra fish (Daniorerio) was discussed by two ways of enzyme activity determination and enzyme gene expression. Methods: The toxicity tests were conducted to determine the lethal toxic effect of ammonia to Daniorerio. Superoxide dismutase (SOD) and acetylcholinesterase (AChE) activities were measured after 3 d and 14 d. RNA from liver was extracted and transcription amounts of AChE,Cu/Zn-SOD, CYP450 were determined by semi-quantitative RT-PCR determination. Conclusion: The 96 h of half lethal concentration (LC50) value was 86.36 mg·L-1. The activity of SOD was without obvious change after 3 d, while a trend of “more active at low concentration and less active at high concentration” was shown after exposed by 14 days. The activity of AChE was inactive all the time and a significant “dose-response” relationship was observed. Compared with enzyme’s activity, the corresponding of gene expression was more sensitive, making it more time-sensitive in the detection of ammonia pollution.

ammonia nitrogen; Daniorerio; SOD; AChE; CYP450

2015-09-30。

国家重大专项资助项目(2012ZX07505-001); 沈阳市科技局计划项目(F15-199-1-22)。

周 莹(1990-),女,河南南阳人,沈阳师范大学硕士研究生; 通信作者:李玥莹(1966-),女,辽宁沈阳人,沈阳师范大学教授,博士。

1673-5862(2016)01-0088-04

X-1

A

10.3969/ j.issn.1673-5862.2016.01.020