张 慧, 房验茹, 齐 悦

(牡丹江医学院 公共卫生学院, 黑龙江 牡丹江 157000)



超声波辅助双酶法提取假酸浆总黄酮及抑菌性检测

张 慧, 房验茹, 齐 悦

(牡丹江医学院 公共卫生学院, 黑龙江 牡丹江 157000)

采用超声波-双酶法提取假酸浆中总黄酮,考察纤维素酶和果胶酶共同作用时酶解时间、酶解温度、pH值以及酶用量对假酸浆中总黄酮提取的影响,考察假酸浆黄酮对几种病菌的抑制作用。结果表明:超声波辅助双酶法提取假酸浆黄酮的最佳工艺条件是:pH值4.6、酶解温度55 ℃、加酶比(果胶酶:纤维素酶)3∶1、酶解时间70 min,此条件下假酸浆中总黄酮的提取率是5.63% 。假酸浆中总黄酮对大肠杆菌、青霉菌、沙门氏菌、和枯草芽孢杆菌有明显的抑制作用,最低抑菌浓度分别为:1.25、2.5、2.5、5 mg/mL。

假酸浆; 黄酮; 超声波-双酶法; 抑菌活性

假酸浆是一种一年生草本植物,原产于秘鲁,现大面积栽培于我国云南、广西等地,具有种植成活率高,收益高等优点。假酸浆可作药用植物使用,具有镇静、止咳、消炎,解毒等功效。假酸浆中黄酮类化合物是一种重要的生物活性物质,具有抑菌性、抗氧化性和抗癌等功效,并且具有降血压和调节免疫细胞效应等多种保健功能,因此研究假酸浆总黄酮具有重要现实意义[1-3]。

植物黄酮的提取方法有水浸法、双水相法、渗透法、超声波提取法和酶法等,超声波能在提取液中产生机械振动和空化作用,可以破坏植物细胞壁,有助于细胞内黄酮类化合物溶出和扩散,超声波法具有提取时间短、操作简便等优点,但提取率不高[4-5]。酶解法的作用机理是使用生物酶促使提取液中物质发生酶解反应,破坏植物组织细胞,提高提取效率。采用单一酶法提取的反应条件温和,不需要高温、高压等特殊条件,操作方便,但提取效率不高,提取物中含有杂质。而采用复合酶法则能同时除去原料中的蛋白质、淀粉等多种干扰成分,提高提取效率[6-8]。本文以假酸浆总黄酮提取率为指标,采用超声波辅助双酶法提取假酸浆中总黄酮,确定最佳提取条件,并测定其抑菌活性,实验结果将为假酸浆黄酮化合物及开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

假酸浆(景东银生农副产品有限公司);芦丁(上海化学试剂公司); 纤维素酶 果胶酶纤(杰诺生物酶制剂公司);硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、无水乙醇等试剂均为分析纯。大肠杆菌、青霉菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌。培养基为牛肉膏蛋白胨培养基。

1.2 仪器与设备

752型紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司);SHB-Ⅱ循环水真空泵(郑州长城科工贸有限公司);SHA-C水浴恒温震荡器(上海医疗器械五厂);MP-200A型电光分析天平(上海第二天平仪器厂);DGH-9070A型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司);SWQ-IA智能数字恒温控制器(南京桑力电子设备厂);超声波清洗器(KQ2200DB)。

1.3 方 法

1.3.1 标准曲线[9]

准确称取芦丁对照品5.0 mg,用70 %乙醇溶解,定容于50 mL容量瓶,摇匀备用。分别移取上述对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0 mL于8只10 mL的容量瓶中,分别加入1 mL 1 % AlCl3溶液,再加70%乙醇定容至刻度,摇匀,静置10 min,用紫外分光光度计,在420 nm处测吸光度。

1.3.2 超声波辅助双酶法提取假酸浆总黄酮单因素实验

以假酸浆总黄酮提取率为考察指标,准确称取粉碎后的假酸浆样品4.0 g,按料液比1∶25加入50%乙醇,使用超声波清洗器超声作用超声功率120 W、超声时间25 min,停止超声。按照1∶1加入果胶酶、纤维素酶,酶解时间40 min,分别考察pH值(3.8、4.2、4.6、5.0、5.4)、酶解温度(40、45、50、55、60)、加酶比m(果胶酶)∶m(纤维素酶)(1∶1、1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1、3.0∶1)、酶解时间(30、40、50、60、70 min)、4个单因素对总黄酮提取率的影响。

1.3.3 超声波辅助双酶法提取假酸浆总黄酮的最佳条件

表1 正交试验因素水平表

1.3.4 假酸浆中总黄酮的抑菌性测定

1.3.4.1菌种的活化和菌悬液的制备

分别将大肠杆菌、青霉菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌于37 ℃恒温培养箱中培养24 h活化稀释,用灭菌移液管吸取0.1 mL灭菌生理盐水,分别将四种菌液稀释为0.5个麦氏比浊度的悬浊液备用[10]。将黄酮粗提液分别配制成质量浓度0.625、1.25、2.5、5、10 mg/mL的溶液,另取一组不加黄酮溶液为对照,过滤除菌,备用。

1.3.4.2 抑菌圈直径的测定

在超净工作台上,将0.5 mL菌悬液分别均匀涂布在固体琼脂平板上,再用无菌镊子夹取经过假酸浆黄酮提取液浸泡30 min的滤纸片,将其按一定距离平铺在在每个平皿中,重复3次。至于37 ℃恒温培养箱中培养24 h,观察假酸浆黄酮的抑菌效果,并用游标卡尺测定抑菌圈直径,取平均值。

1.3.4.3 最小抑菌浓度(MIC)的测定

将质量浓度0.625、1.25、2.5、5、10 mg/mL假酸浆黄酮类化合物供试液,分别加入到已灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基中混匀,配制成含黄酮质量浓度的分别为0.312、0.625、1.25、2.5、5 mg/mL系列培养基。用移液枪分别点种供试菌液10 uL,菌液干后置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h,菌落生长被完全抑制的最低药物质量浓度为该黄酮液对检测菌的MIC。每组三个平行样,以不含黄酮的培养基作对照。

2 结果与分析

2.1 标准曲线方程

按1.3.1节方法测定其吸光度Y=18.862x-0.003 4(r=0.999) 。式中Y为吸光度值,x为被测样品中黄酮含量,相关系数(r=0.999)。

式中:提取率以1g假酸浆提取总黄酮的毫克数表示,单位为mg/g;C为质量浓度/(mg/mL);V为滤液定容体积 /mL;m为使用假酸浆的质量/g。

2.2 超声波辅助双酶法提取假酸浆总黄酮的单因素实验

2.2.1 pH值对假酸浆总黄酮提取率的影响

图1表明,随着pH值的增大总黄酮的提取率增大,当pH4.6时提取率达到最大,其原因是复合酶发挥最大活性,破坏细胞壁,降低传质阻力,使得总黄酮的溶出效率达到最大值[11-13]。但是pH值达到4.6以后提取率逐渐降低,这是由于纤维素酶在趋于碱性环境中酶活性会逐渐降低并失活,因此酶解最适pH值为4.6。

2.2.2 酶解温度对假酸浆总黄酮提取率的影响

图2表明,酶解温度在40～60 ℃之间时,起初假酸浆总黄酮的提取率随着温度升高不断增加,当酶解温度达到55 ℃时提取率最高,之后随着酶解温度升高提取率呈下降趋势。其原因是酶解温度较低时,复合酶活力较低,提取率较低;当酶解温度超过55 ℃时,复合酶生物活性破坏,酶活力减弱提取率降低。

图2 酶解温度对假酸浆总黄酮提取率的影响

2.2.3 加酶比对假酸浆总黄酮提取率的影响

图3表明,随着加酶比(果胶酶:纤维素酶)的增加,假酸浆总黄酮提取率逐渐增加,加酶比为2.5∶1时,总黄酮的提取率达到最高,其原因是假酸浆细胞壁的结构与果胶酶、纤维素酶2种酶共同作用时呈适应性。后随着加酶比增大提取率反而降低,这是由于酶解产物的生成对酶解反应产生竞争性抑制作用[14-15]。因此最佳酶解比(果胶酶:纤维素酶)为2.5∶1。

2.2.4 酶解时间对假酸浆总黄酮提取率的影响

图4表明,假酸浆总黄酮在纤维素酶和果胶酶共同作用时,提取率随着酶解时间延长总黄酮提取率迅速增加,其原因是随着时间的延长,酶活性得到充分利用,酶解反应进行得较完全,但提取时间超过50 min后提取率增加缓慢,其原因可能是产物的积累抑制了酶的活性[16-17]。因此本实验选用时间为50 min。

图3 加酶比对假酸浆总黄酮提取率的影响

图4 不同酶解时间对总黄酮提取率的影响

2.2.5 超声波辅助双酶法提取假酸浆总黄酮的正交试验及结果

由表正交试验极差结果表明:各因素对假酸浆总黄酮提取率的影响的主次顺序依次为,pH>酶解比>酶解温度>酶解时间,得到的最佳提取条件为A2B2C3D3即pH值为4.6、酶解温度55 ℃ 、酶解比3∶1、酶解时间70 min。在此条件下,进行3次验证试验,得到假酸浆总黄酮提取率为5.63%。

表2 正交试验设计及结果

2.3 假酸浆总黄酮的抑菌性结果

2.3.1 假酸浆总黄酮化合物抑菌圈直径的测定

按1.3.4.2方法测定抑菌圈大小,假酸浆总黄酮对大肠杆菌、青霉菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径见表3,由表3可以看出假酸浆总黄酮表现出良好的抑菌活性。

表3 假酸浆总黄酮抑菌性实验结果

注:表中数据为3次平行试验的平均值:“—”表示无抑菌效果。

2.3.2 假酸浆中总黄酮化合物最低抑菌浓度(MIC)

按照1.3.4.3方法,测定假酸浆总黄酮化合物的最小抑菌浓度(MIC)其结果见表4所示。由表4可知对大肠杆菌、青霉菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度分别为1.25、2.5、2.5、5 mg/mL。相同条件下,假酸浆总黄酮对同一菌种的抑制程度与黄酮的浓度呈正相关。

表4 假酸浆总黄酮对供试菌MIC值测定

注:-表示无菌生长:+表示细菌生长:++表示大量细菌生长。

3 结 论

结合单因素试验和正交试验,对假酸浆总黄酮提取率进行分析得到最佳提取条件为:酶解温度55 ℃、pH值4.6、酶解时间70 min、 加酶比(果胶酶:纤维素酶 )3∶1,在此条件下总黄酮提取率为5.63%。

假酸浆总黄酮对供试菌的抑制作用存在一定差异,对大肠杆菌、青霉菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径分别为13.16、10.62、10.52、14.6 mm,抑制效果分别为沙门氏菌<青霉菌<大肠杆菌<枯草芽孢杆菌。

假酸浆总黄酮对大肠杆菌、青霉菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度分别为1.25、2.5、2.5、5 mg/mL。 因此从假酸浆中提取总黄酮,可应用于食品、药品、化妆品等方面,具有良好的市场开发应用前景。

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Total flavonoids of nicandra physaloides extraction by ultrasonic-assistant double-enzymatic method and bacteriostatic test

ZHANGHui,FANGYanru,QIYue

(College of Public Health, Mudanjiang Medical College, Mudanjiang 157000, China)

To extract total flavonoids by ultrasonic-double-enzumatic method, using nicandra physaloides as raw material, we investigated the effect of enzymolysis time, enzymolysis temperature, pH value and enzyme dosage on total flavonoids of nicandra physaloides extraction, together with combined effect of cellulase and pectinase. Also, the inhibition of some germs by flavonoids of nicandra physaloides was investigated in details. The results show that, the optimum technological conditions for flavonoids of nicandra physaloides extraction by ultrasonic-double-enzumatic method are as follows :enzymolysis temperature 55 ℃, pH value4.6, enzymolysis time70 min, enzyme ratio (pectinase: cellulase) 3∶1, and the extraction ratio of the total flavonoids of nicandra physaloides under the conditions is 5.63%. The total flavonoids of nicandra physaloides have obvious inhibition on escherichia coli, penicillium, salmonella and bacillus subtilis In additon, the minimal inhibitory concentrations are 1.25,2.5,2.5,5 mg/mL respectively.

nicandra physaloides; flavonoids; ultrasonic-double-enzumatic method; bacteriostatic activity

2015-06-30。

黑龙江省科技厅自然科学基金资助项目(B2009-4)。

张 慧(1989-),女,黑龙江牡丹江人,牡丹江医学院实验师,硕士。

1673-5862(2016)01-0078-05

文献标志码: A

10.3969/ j.issn.1673-5862.2016.01.018