姜海蓉 综述，崔玉花，彭方毅审校

(1.重庆市公共卫生医疗救治中心检验科　400036；2.重庆市垫江县中医院　408300)



·综述·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.26.040

用于人患布鲁菌病PCR诊断方法的研究进展*

姜海蓉1综述，崔玉花1，彭方毅2△审校

(1.重庆市公共卫生医疗救治中心检验科400036；2.重庆市垫江县中医院408300)

布鲁菌病；PCR；诊断；分型

布鲁菌病是由胞内寄生菌布鲁杆菌侵染人体后产生的一种传染-变态反应性疾病。家畜是首要宿主，并可通过生殖黏膜，呼吸、消化道黏膜，蚊虫叮咬等传播。家畜患布鲁菌病后会有不孕不育、流产、胎盘滞留、产奶量下降等临床症状。而当人摄入布鲁菌污染的鲜奶，处理患畜生鲜肉，为患畜接生，处理流产胎仔时，被感染的风险会很大。人感染布鲁菌后的临床症状主要是发热、多汗、关节疼痛、肌肉痉挛、睾丸发炎等，甚至还会导致不孕不育[1]。人患布鲁菌病有急性期和慢性期之分。当急性患者转为慢性时会反复发作长期不愈，少数患者会导致死亡。

布鲁菌是一种革兰阴性菌，属于α-变形菌群，从1886年Bruce发现布鲁菌至今已有约100多年的历史。目前，布鲁菌有6个经典种：牛种、羊种、猪种、犬种、绵羊附睾种、沙林鼠种，两种新发现的种：田鼠种和B.inopinata，还有两种从海洋哺乳动物中分离的布鲁菌[2]。而羊种、牛种、猪种布鲁菌是公认的使人体致病的3种布鲁菌，也有犬种布鲁菌感染人的案例，但这种情况较少发生。

虽然细菌分离培养是诊断布鲁菌的金标准，但这一方法要接触活菌进行研究分析，对研究人员也具有潜在的感染隐患，而且还有实验周期长，对实验人员技术及实验设备要求高等缺点，使其不能被推广使用。因此安全有效、简单快速的PCR检测方法用于布鲁菌病的检测更受人们期待。科学家们也已经报道了至少400多篇关于将PCR方法用于检测布鲁菌的文章[3]。而利用血液、组织标本、体液等各种临床样品进行PCR检测的技术方法也已经在世界上各实验室中开展研究，并取得了一定的成果。应用PCR方法检测各组织标本中的布鲁菌前，第一步是DNA的提取，提得的DNA质量是影响PCR检测成功与否的关键步骤。在本综述中，讨论了布鲁菌DNA的提取方法和用于检测的各种PCR技术。

1　布鲁菌DNA的提取

目前细菌DNA的提取方法已经有标准化提取步骤，如氯仿抽提法(蛋白酶K法)、碘化钠(NaI)提取法。也有应用于纯菌、组织、血样等临床标品DNA提取的商业化试剂盒，如QIAGEN的QIAamp DNA blood mini kit、天根的血液/组织DNA提取试剂盒、Progama的Blood gDNA Miniprep System等。

Lusk等[4]曾经用6种细菌DNA提取试剂盒提取不同奶制品样品中的布鲁菌DNA，并用实时荧光PCR来对比不同试剂盒提取的DNA质量。结果显示，QIAGEN的液体中DNA提取步骤对布鲁菌的提取效果最好，而PrepSEQ和MagMAX kit的布鲁菌DNA提取效果最差。Piranfar等[5]也曾经用4种不同的DNA提取试剂盒提取纯菌和血样中的布鲁菌DNA，并证明MagNA Pure LC对纯菌及血样中的DNA提取更灵敏。这些研究结果表明，不同的DNA提取试剂盒提取的DNA产物的质量是有差异的。

血液通常是人患布鲁菌病的PCR诊断所利用的临床标本，而血样DNA提取产物中可能存在的乙二胺四乙酸(EDTA)、血红素、核糖核酸酶、肝素等成分都会抑制PCR反应[6]。而在提取DNA之前，将血液用水或裂解缓冲液反复清洗几遍直到去除所有血红蛋白，会大大增加PCR检测的灵敏度[3]。所以在提取血样DNA之前，待检血样的预处理及合适的提取方法决定了后续PCR检测样品的灵敏性。

2　单引物PCR技术

至今，已有多篇报道将单引物PCR技术应用于人类布鲁菌病的诊断。有研究称，PCR检测方法比细菌分离培养方法更灵敏，而且可以用于初次感染的诊断，也可用于复发的早期诊断。用于检测布鲁菌的单引物PCR技术针对的目的基因有表达外膜蛋白的布鲁菌外膜蛋白31基因(BCSP31)，且该引物(B4/B5)已被多次证明具有高特异性[7]，并沿用至今。还有一些其他的属特异引物如omp2(JPF/JPR)、per(bruc1/bruc5)、插入序列IS711等[8]。

不同引物之间的灵敏度和特异度都有很大差异，Piranfar等[5]用B4/B5、插入序列IS711的引物ISP1/ISP2、引物F4-R2和JPF/JPR检测人血样中的布鲁菌，并对比这4对针对不同目的基因的引物灵敏度。实验结果显示，3对引物B4/B5、ISP1/ISP2、F4/R2的检测最低限分别为100、200、800 CFU/mL，引物JPF/JPR不能从血液中检测出布鲁菌。目的基因BCSP31的引物B4/B5灵敏性最好。也很多研究报道对比过B4/B5、F4/R5和JPF/JPR这3对引物的PCR方法。多次实验证明，这些常用的PCR引物在检测人体中的布鲁菌基因组DNA时的扩增灵敏度是存在差异的。质量好的引物除了特异性好，不形成引物二聚体以外，扩增灵敏度高也是必要条件，所以在建立PCR检测方法时，对其特异性引物的要求就比较高。

3　多重PCR技术

多重PCR方法是一种在同一管中可以在检测布鲁菌的同时区分不同的种型的技术，也可用于同时检测不同的病原体。它的优点是省时、高效，大大降低了试剂的用量和成本。多重PCR方法是由传统PCR方法演变而来的，可根据布鲁菌基因中不同种之间基因多态性而选择出种型特异性基因靶点，设计出一系列引物，从而以扩增片段的大小区分不同的种型。也可根据布鲁菌不同目的基因，通过目的基因扩增产物的组合来判断布鲁菌不同的种型。

布鲁菌中插入序列IS711是一种多拷贝基因，在基因中的位置也十分稳定。不同种布鲁菌中IS711的拷贝数不同,一般是6、7个拷贝，如羊种、牛种、犬种，绵羊种拷贝数较多，为38个[9]。有研究人员根据插入序列IS711在布鲁菌不同种之间的特异性,设计出特异性引物，即以1S711基因特异上游序列为基础设计公共上游引物，以其基因下游种特异性位点设计特异性下游引物,然后根据扩增产物大小来区分不同种和生物型。这一多重PCR检测方法为AMOS-PCR，能够区分牛种1、2、4型，羊种1、2、3型，猪种1型及绵羊附睾种。也有研究者将多重PCR应用于几种病原菌的同时检测，Batra等[10]建立了一种在同一反应体系中能够检测出炭疽杆菌、鼠疫菌、类鼻疽伯克菌和布鲁菌4种病原菌的多重PCR方法，大大减少了人力、物力的消耗。随着PCR技术的发展，研究者们不断地追求更简单高效的PCR检测方法，Bruce ladder就是AMOS PCR的一种延伸，它可以混合引物单管区分出布鲁菌6个经典的亚种，海洋种布鲁菌及疫苗株S19、RB51和Rev1，能够高效低耗地进行分型鉴定。

2013年，Sanjuan-Jimenez等[11]报道过一种应用多种不同引物组合同时检测出结合分枝杆菌和布鲁菌的方法，应用的目的基因是布鲁菌BCSP31和IS711及结核分枝杆菌的senX3-regx3和IS6110，组成3对不同的引物。也有一些其他的报道应用该方法同时检测布鲁菌及结核分枝杆菌，利用的靶基因分别是布鲁菌BCSP31、IS711、omp2a和结核分枝杆菌的regx3、cfp31及IS6110[12-13]。诸多的此类报道证明，多重PCR技术因其省时、省力、低成本等优点，应用于布鲁菌及结核分枝杆菌的鉴别与诊断具有一定的实用性及良好的应用前景。

多重PCR技术应用于布鲁菌的种型分析的方法研究已日渐完善，除了新发现的两个布鲁菌种，其他都可以鉴别出，Bruce ladder用于鉴别布鲁菌亚种的方法也已经被世界动物卫生组织(OIE)手册收录。近几年研究者们更热衷于将多重PCR技术应用于同时检测不同病原的研究。

4　荧光PCR技术

实时荧光PCR技术最初是由美国ABI公司研制出的，并在最近几年得到发展。2001年，Redkar等[14]将荧光PCR应用于布鲁菌检测并在物种水平上分出牛种、羊种和猪1型布鲁菌，他们借鉴AMOS PCR的原理，利用插入序列IS711在布鲁菌不同种之间的多态性构建共用上游引物及种特异性下游引物。之后Piranfar等[5]将Redkar文章中报道的羊种引物及探针用于荧光PCR并与传统PCR进行对比。实验结果显示，荧光PCR检测样品DNA的灵敏度明显高于传统PCR。这些研究中应用于荧光PCR的染料多是探针类染料，其他还有荧光类染料作为荧光PCR的荧光信号。但曾有研究报道，将荧光PCR水解型探针和荧光染料进行对比，结果显示应用水解型探针的荧光PCR实验特异性更好。

实时荧光PCR技术因其操作更简单、快速、灵敏度及特异度更高等特点，更适于布鲁菌病的检测。而且，这一实验技术易于标准化，且对实验室工作人员的感染风险极低。据报道，将荧光PCR技术、间接酶联免疫吸附试验(IELISA)、竞争酶联免疫吸附试验(CELISA)、虎红平板凝集试验(RBT)、细菌分离培养技术分别用于血液、组织等临床标本的检测，结果证实荧光PCR检测技术最灵敏。Probert等[15]还将荧光定量PCR应用于人患布鲁菌病的诊断治疗和愈后跟踪调查，实验结果显示该方法对人体内布鲁菌菌量的变化是一种有效可信的检测方法。在进行布鲁菌病的防控过程中，区分出疫苗株与野毒株感染也是预防疾病传染的有效手段。Kaynak-Onurdag等[16]建立了一种用于区分布鲁菌疫苗株与野毒株的荧光定量PCR方法，用于有效地区分疫苗株与野毒株感染。

也有研究建立了一种鉴别猪种布鲁菌的荧光定量PCR方法，并报道是检测布鲁菌样品的荧光定量PCR方法中灵敏度最高的[17]。Sidor等[18]也将William等设计的布鲁菌属特异性引物及探针应用于组织、血液等临床标本的布鲁菌检测，并加入了用于质量控制的两种内参基因，组成了多重荧光定量PCR检测布鲁菌属的试验方法。该试验方法可以监控组织样品中DNA是否提取成功及提取的DNA产物的质量，从而保证了后续荧光PCR方法检测结果的有效性。也有研究报道表明，将荧光定量PCR技术应用于布鲁菌病、钩端螺旋体和胎儿弯曲杆菌的检测，该实验建立了一种多重荧光定量PCR检测方法，在1个反应体系中可同时检测出3种疾病[19]，充分显示了荧光定量PCR方法的高特异度及高灵敏度。而特异性好，灵敏度高的实时荧光PCR技术在应用于人布鲁菌病诊断方面具有很大的前景，它的实时定量功能可以在治疗过程中追踪患者的病情变化，也可以用于复发诊断。

近两年来，依据单核苷酸多态性(SNP)位点建立的高分辨率熔点曲线分析法，用于检测布鲁菌和基因分型是科学家们的研究热点。如Gopaul等[20]建立的高分辨率熔点曲线分析法，可将布鲁菌各经典种与其他种属细菌分辨开。之后 Mohamed Zahidi等[21]也根据SNP位点建立的高分辨熔点曲线分析法用于布鲁菌亚种之间的分析，并在41株样品的检测中得到40株为羊种布鲁菌，1株为猪种布鲁菌。高分辨率溶解曲线是一种新型的基因分析技术，具有极高的敏感度和准确度，并且这种技术速度快、成本低、通量高，且不受检测位点的局限，实现了真正的闭管操作。在基因的分型、SNP分析、突变扫描、序列匹配等方面，高分辨熔解曲线分析技术发挥着重要作用。

与常规PCR相比，荧光定量PCR技术因其更高的特异度、灵敏度，耗时短，不需要进行电泳分析，避免了DNA污染等优点，更适用于人类布鲁菌病的检测工作。而且PCR实验技术本身比其他血清学或细菌分离培养等检验方法更简单安全，灵敏且高效。所以荧光定量PCR检测技术用于人布鲁菌病的检测更受人们期待。

5　其他PCR方法

应用于布鲁菌检测研究的PCR方法,除了标准PCR方法及其衍生物多重PCR方法和荧光定量PCR方法外，还有其他各种基于PCR的检测方法。如用BCSP31和IS711两种特异性基因建立半巢氏PCR,并通过对人全血的布鲁菌检测评价该方法的检测性能。也曾有报道利用IS711属特异性基因设计两对套嵌式引物，构建了巢氏PCR方法并应用于人患布鲁菌病的检测，增加了检测的灵敏性和特异性。巢氏、半巢氏PCR方法的建立，在一定程度上提高了PCR检测的灵敏度和特异度。

用多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)方法建立种系关系进化树，此方法可以用于流行病学的追踪调查及确定分离株的亲缘关系。2015年有报道过，用16位点的可变数目串联重复序列(VNTR)方法将布鲁菌进行基因分型，并建立了一定的进化树分析[22]。之后又有报道，从人或动物体内分离出了布鲁菌，通过进化树关系分析，人感染的多为人兽共患的菌株，我国多个地区也通过MLVA方法分析出本地区布鲁菌来源及地区之间的进化关系[23-24]。在我国，Jiang等[25]用MLVA检测方法从人体中分离鉴定出了羊种1、2、3型，之后他们又从人和动物中分离出羊种、牛种布菌及猪种S2疫苗株，并指出应用猪种S2疫苗对动物和人类都存在较大的感染风险。另外，随机引物扩增多态性DNA的PCR技术(RAPD)是利用不同的随机排列碱基顺序的短寡聚核苷酸单链为引物,对靶DNA进行PCR扩增后进行多态性分析。RAPD技术现在已经广泛应用于生物的品种鉴定、系谱分析及进化关系的研究上。

中国布鲁菌病的日益严重，使得对其防控与诊断技术的要求越来越高。而防控技术属国家层面的政策支持，布鲁菌病诊断技术的重要性也就尤为突出。大量的报道结果已经证明，PCR技术用于布鲁菌的检测具有很好的利用价值，而且PCR方法已应用于人类布鲁菌病的检测研究，它表现出的高效、安全、灵敏度高、特异度好等优点将是用于临床检测的有利因素，也可以作为细菌分离培养和血清学检测方法的补充诊断。但是，作为一种正处在开发试用阶段的新型检测方法,PCR并没有一个标准的检测方案,而且DNA的质量、PCR反应管、反应试剂的质量等都会影响检测结果的有效性。因此，标准阴阳性样品的建立或内(外)源性内参基因的设计等都要应用于PCR检测方法中，来提高检测方法的可靠性。

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重庆市卫生局科研项目(2012-2-383)。作者简介：姜海蓉(1970-)，讲师，硕士，主要从事疫苗与诊断技术研究。△

，E-mail:362505110@qq.com。

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