储维维，张烨，段晓梅，蒋春艳，章虎（大理学院药学与化学学院，云南大理671000）



大理野生蕨菜总黄酮的提取及抗氧化活性研究

储维维，张烨*，段晓梅，蒋春艳，章虎
（大理学院药学与化学学院，云南大理671000）

摘要：以大理野生蕨菜为试材，采用乙醇回流法提取蕨菜中的总黄酮，以总黄酮提取率为指标，通过正交试验设计对提取工艺进行优化，并利用体外抗氧化测试法对总黄酮进行了总抗氧化能力和还原力研究。结果表明最佳提取条件为，50 %的乙醇溶液，1∶50（g/mL）的料液比，80℃回流提取1 h，蕨菜总黄酮提取率可达10.33 %。蕨菜中总黄酮的还原力、对超氧阴离子自由基、羟自由基的清除率均和浓度呈正相关，当浓度达到0.12 mg/mL时，对超氧阴离子自由基、羟自由基的清除率分别达到64.72%、57.53%。

关键词：野生蕨菜；总黄酮；提取工艺；正交试验；抗氧化性

蕨菜（Pteridium aquilinum var. latiusculum）属凤尾蕨科，又叫拳头菜、拳菜、猫爪、龙头菜、鹿蕨菜、蕨儿菜、猫爪子、蕨苔、锅莲，蕨菜在我国分布较广，种类很多，不同的地区品种各有特色，喜生于浅山区向阳地块，多分布于稀疏针阔混交林，在云南分布广泛，其食用部分是未展开的幼嫩叶芽以及上半段较嫩的茎干[1]。蕨菜，营养丰富，含有多种维生素、氨基酸、以及人体所需的多种微量元素，是理想的健康食品和有待开发利用的天然食品资源[2-3]。蕨菜还含有许多药用成分蕨菜能入药，有解毒、清热、润肠、降气等功效，可用于治疗高血压、糖尿病、湿热黄疸、风湿性关节炎等症状，具有很好的药用价值[4-6]。蕨菜中含有丰富的的黄酮类物质[7-9]，黄酮类化合物具有改善血液循环、降血脂、降血糖、抗氧化、增强机体免疫力、抗肿瘤、抗衰老、治疗心脑血管疾病等保健功能，在医药、食品领域具有广阔的开发应用前景[10-12]。已被联合国教科文组织列为“世界地质公园”的大理苍山位于低纬度高海拔的滇西北高原，动植物资源丰富。得天独厚的自然条件和气候条件很适宜蕨类植物生长，野生蕨菜分布广阔，但目前开发利用较少，蕨类植物中黄酮类化合物方面的研究已有报道[2，13-16]，但有关大理苍山野生蕨菜中黄酮类化合物的研究未见报道。本试验在单因素试验基础上采用采用正交试验法从大理苍山野生蕨菜中提取总黄酮，以确定出最佳提取条件，为进一步的开发利用其提供理论参考。

1材料与方法

1.1材料与试剂

蕨菜：2014年5月22日采自云南省大理苍山云弄峰花甸坝，野外采集后室内风干，粉碎备用。

芦丁：成都曼思特生物科技有限公司；无水乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、苯酚、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、邻苯三酚、30 %过氧化氢、硫酸亚铁、盐酸、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、水杨酸、三羟甲基氨基甲烷、抗坏血酸（VC）：均为国产分析纯；试验用水实验室自制为去离子水和蒸馏水。

1.2仪器与设备

HWS24型电热恒温水浴锅：上海-恒科技有限公司；AL204-IC型电子分析天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；TU-1901双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司。

1.3方法

1.3.1黄酮含量测定

1.3.1.1供试品溶液的制备

准确称取已粉粹的蕨菜样品1.00 g，按试验条件料液比、乙醇浓度、提取温度和提取时间进行提取，趁热抽滤、浓缩，将滤液转移至50 mL容量瓶，用70 %的乙醇定容至刻度，即得供试品溶液。

1.3.1.2标准曲线的绘制[17-18]

精确称取芦丁对照品0.008 0 g，70 %乙醇微热溶解，用70 %乙醇定容至50 mL，配制成0.160 0 mg/mL的芦丁对照品溶液，备用。分别吸取该对照品溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00 mL于25 mL容量瓶中，用70 %乙醇添至10 mL，加入5 %亚硝酸钠溶液1.00 mL，摇匀，静置6 min，10 %硝酸铝溶液1.00 mL摇匀，静置6 min，再加入4 %氢氧化钠溶液10 mL，加蒸馏水至刻度，摇匀，静置15 min；空白对照直接加70 %乙醇10 mL，其余所加试剂同上，加蒸馏水至刻度。用紫外分光光度计在400 nm~600 nm处做扫描出最大吸收波长为505 nm。在最大吸收波长下，分别测定以上系列标准溶液吸光度，绘制标准曲线得回归方程y=8.138 0x-0.004 2（R2=0.999 6），见图1。

1.3.1.3总黄酮的含量测定

精密吸取蕨菜的供试品溶液1 mL各2份分别于50 mL，用70 %乙醇添至10 mL，加入5 %亚硝酸钠溶液2.0 mL，摇匀、放置6 min、再加入10 %硝酸铝溶液2.0mL，摇匀，放置6min，再加入4%NaOH溶液20 mL，混匀，再用蒸馏水定容至刻度，摇匀，放置15 min。在505 nm处测得吸光度，代入回归方程根据提取总体积和稀释倍数按下式计算总黄酮提取率。

式中：x为样品中总黄酮含量（以芦丁计）；m1为根据标准曲线计算出待测液中总黄酮的量，mg；V1为测定样品提取液体积，mL；V2为样品提取液总体积，mL；m2为蕨菜样品质量，g。

图1芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of Rutin

1.3.2单因素试验

对提取温度、料液比、乙醇浓度、提取时间进行单因素研究，分别考察这4个因素对总黄酮提取率的影响。

1.3.3正交试验优化设计

在单因素试验基础上，对各因素的提取温度（A）、料液比（B）、乙醇浓度（C）、提取时间（D）四因素对总黄酮提取工艺进行正交试验，并以总黄酮含量作为提取工艺的判断指标。选用L9（34）正交表进行试验，因素水平见表1。

表1正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonaI test

1.3.4抗氧化性试验

1.3.4.1蕨菜总黄酮的还原力测定[19-20]

如果物质是电子给予体，它可将Fe3+还原成Fe2+，能与Fe3+形成普鲁士蓝，其在700 nm处有最大吸收峰。吸光度越大，抗氧化能力越强。分别吸取不同浓度的样品液2.5 mL于三角烧瓶中（每个浓度取3份平行），加入pH6.6的磷酸盐缓冲液2.5 mL、1 %K3Fe（CN）6溶液2.5 mL，添水至10 mL，混合均匀，混合液于50℃保温20 min，再加入2.5 mL10 %的三氯乙酸溶液，混合后3000r/min离心10min。取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸馏水，加入0.5 mL 0.1 %的FeCl3溶液，室温放置10 min，测定反应液在700 nm处的吸光度，吸光度越大则说明其还原能力越强，抗氧化性也越强。

1.3.4.2对超氧阴离子自由基（O2-·）清除率的测定[21-22]

采用邻苯三酚自氧化法。向三角烧瓶中依次加入0.05 mol/L pH 8.2的Tris-HCl缓冲液5 mL、加入2 mL蒸馏水，置25℃水浴中预热20 min，分别精确吸取不同浓度样品液2 mL（每个浓度取3份平行），立即加入在25℃水浴中预热的3 mmol/L邻苯三酚1 mL，立即混匀，在25℃水浴中准确反应4 min后，加入10 mol/L 的HCl溶液1 mL终止反应，（以0.01 mol/L HCl为参比，不加样品液为空白，空白中样品液以2 mL蒸馏水代替），并于320 nm处测定吸光度。按照同样方法以同浓度VC做阳性对照。按下式计算O2-·清除率%：

式中：A0为空白对照液的吸光度；An为加入黄酮溶液后的吸光度。

1.3.4.3对羟自由基（·OH）清除率的测定[23-25]

采用水杨酸法，利用Fenton反应产生具有高反应活性的·OH。如果在体系中含有清除·OH能力的物质，能与水杨酸竞争·OH，使水杨酸捕捉羟·OH后产生的有色物质生成量减少，该物质在510 nm处有最大吸收。向每个三角烧瓶中依次加入2 mL浓度9 mmol/L水杨酸-乙醇，2 mL浓度9 mmol/L的FeSO4溶液混匀，加入不同浓度样品液2 mL（每个浓度各3瓶）（0号做空白对照，加入2 mL去离子水），再加入2 mL浓度8.8 mmol/L的H2O2（考虑到待测溶液自身的吸光度，每个浓度下有一瓶不加H2O2，以2 mL去离子水代替，作为本底吸收An0），于37℃反应30 min，以去离子水为参比，然后在510 nm波长下分别测定吸光度An，按照同样方法以同浓度VC做阳性对照。按下式计算·OH清除率%：

式中：A0为空白对照液的吸光值；An为加入待测溶液后的吸光值；An0为不加H2O2时待测溶液的吸光值。

2结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1提取温度对总黄酮提取率的影响

准确称量1.00 g样品，1∶30（g/mL）的料液比，用70%的乙醇溶液分别以水浴温度20、40、60、80、90℃下回流提取2 h，按1.3.1.3项下方法显色，用蒸馏水定容，测定吸光度，计算蕨菜中总黄酮提取率，结果见图2。

图2提取温度对总黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of the extraction temperature on total flavonoids yield

随着温度的增加，总黄酮提取率增加，在80℃时达到最大值，继续升高温度到90℃后降低。综合各方面因素，正交试验温度3个水平设置为75、80、85℃。

2.1.2料液比对总黄酮提取率的影响

准确称量1.00 g样品，用70 %的乙醇水溶液，分别以1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70（g/mL）的料液比，70℃下回流提取2 h，按1.3.1.3项下方法显色，用蒸馏水定容，测定吸光度，计算蕨菜中总黄酮提取率，结果见图3。

图3料液比对总黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of the solid-liquid ratio on total flavonoids yield

总黄酮提取率随着料液比增加而增加，超过1∶50后，提取率随料液比的增大而减小，因此回流提取料液比因素的水平设置为1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）。

2.1.3乙醇浓度对总黄酮提取率的影响

准确称量1.00 g样品，1∶30（g/mL）的料液比，70℃的水浴，分别以20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %的乙醇溶液回流提取2 h，按1.3.1.3项下方法显色，用蒸馏水定容，测定吸光度，计算蕨菜中总黄酮提取率，结果见图4。

乙醇浓度在40 %~50 %之间，总黄酮提取率有最大值，因此，正交试验中乙醇浓度水平设置为30 %、40 %、50 %。

图4乙醇浓度对总黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of the ethanol concentration on total flavonoids yield

2.1.4提取时间对总黄酮提取率的影响

准确称量1.00 g样品，1∶30（g/mL）的料液比，70 %乙醇水溶液，分别回流提取0.5、1、1.5、2、2.5、3 h，按1.3.1.3项下方法显色，用蒸馏水定容，测定吸光度，计算蕨菜中总黄酮提取率，结果见图5。

图5提取时间对总黄酮提取率的影响Fig.5 Effect of the extraction time on total flavonoids yield

1.5 h提取率最高，因此回流提取时间因素设置为1、1.5、2 h。

2.2正交试验结果

在单因素试验基础上，对各因素的提取温度（A）、料液比（B）、乙醇浓度（C）、提取时间（D）四因素对总黄酮提取工艺进行正交试验，试验安排及结果见表2。

表2正交试验结果Table 2 Results of orthogonal test

续表2正交试验结果Continue table 2 Results of orthogonal test

由表2可得出，各因素对蕨菜中总黄酮的提取率影响主次顺序呢依次为：提取温度（A）>乙醇浓度（C）>料液比（B）>提取时间（D）；以极差最小的D因素为误差项进行方差分析见表3。

表3方差分析结果Table 3 Results of variance analysis

结果表明A因素的影响最显著，其他因素均无显著影响。A2，A3对提取效果的影响差异较小，但降低温度有利于节能。提取时间（D）的影响最小，而缩短提取时间也有利于提高工作效率和降低能耗，D1和D2的效果更接近，故综合能耗因素考虑，确定优化提取条件为A2B2C3D1。即1∶50（g/mL）的料液比，50 %的乙醇溶液为提取液，80℃下回流提取1 h。

2.3验证试验

精确称取1.00 g蕨菜粉，按照优化提取工艺条件A2B2C3D1下进行5次平行验证试验，按1.3.1.3项下方法显色，用蒸馏水定容，测定吸光度A，计算蕨菜中总黄酮平均提取率10.33 %，RSD值为0.59 %。

2.4抗氧化性

2.4.1蕨菜总黄酮的还原力测定

采用普鲁士蓝法测定测定总抗氧化性，通过溶液的吸光度的变化来评价还原力的大小。以不同浓度的VC为阳性对照，测定了蕨菜总黄酮还原能力，见图6。

由图6可见，蕨菜总黄酮还原能力弱于VC。但其还原力随黄酮类化合物溶液浓度的升高而加强，试验结果经线性回归得相关系数R2=0.997 5。

图6蕨菜总黄酮的还原力Fig.6 The reducing power of total flavonoids

2.4.2对超氧阴离子自由基（O2-·）清除率的测定

以不同浓度的VC为阳性对照，研究了蕨菜总黄酮对超氧阴离子自由基的清除率，见图7。

图7蕨菜总黄酮对超氧阴离子自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effects of flavonoids on superoxide anion free radical

由图7可见，其清除效果随黄酮类化合物溶液浓度的升高而加强，呈正相关关系，实验结果经线性回归得相关系数R2=0.992 8。当浓度均为0.12 mg/mL时，VC和蕨菜总黄酮对超氧阴离子自由基的清除率分别为77.64 %、64.72 %。表明蕨菜总黄酮对超氧阴离子自由基（O2-·）有较好的清除作用。

2.4.3对羟自由基（·OH）清除率的测定

以不同浓度的VC为阳性对照，研究了蕨菜总黄酮对对羟自由基的清除率，见图8。

图8蕨菜总黄酮对羟自由基的清除作用Fig.8 Scavenging effects of flavonoids on hydroxyl radical

由图8可知，蕨菜总黄酮对羟自由基的清除能力较强。当浓度均为0.12 mg/mL时，VC和蕨菜总黄酮对羟自由基的清除率分别为70.87 %、57.53 %。其清除率随黄酮浓度增大而增加，但清除作用没有VC强。

3　结论

本试验在单因素试验的基础上，采用正交试验优化了野生蕨菜中总黄酮提取工艺条件。单因素试验结果表明，影响野生蕨菜总黄酮提取率的因素依次为提取温度（A）>乙醇浓度（C）>料液比（B）>提取时间（D）；优化的提取工艺采用1∶50（g/mL）的料液比，50 %的乙醇溶液为提取液，80℃下回流提取1 h。提取率可达10.33 %，RSD值为0.59 %。

抗氧化性结果表明，蕨菜黄酮类化合物对超氧阴离子自由基、羟自由基具有较强的清除作用，且其清除效果随着蕨菜黄酮浓度的增加而加强。当浓度为0.12 mg/mL时，对超氧阴离子自由基和羟自由基的清除率分别为64.72 %和57.53 %。说明蕨菜黄酮类化合物具有良好的抗氧化性，对生物机体具有保健功效。

从试验结果看大理苍山野生蕨菜中总黄酮含量较高，但植物中总黄酮含量受气候、产地的影响较大，因此对不同产地野生蕨菜应进一步进行系统的品质评价研究。野生蕨菜分布广阔，资源蕴藏量大，乙醇回流法在工业生产中是较成熟的提取方法，该试验结果可为大理苍山野生蕨菜资源的开发利用提供参考依据。

参考文献：

[1]中国科学院《中国植物志》编委会.中国植物志[M].北京:科学出版社,1999:25

[2]张晓娟,胡选萍,周建军,等.蕨菜化学成分及开发应用研究进展[J].食品研究与开发,2014,35(3):119-121

[3]樊锦慧,高克立,赵毅军.蕨菜的研究概况[J].甘肃医药,2012,31 (1):51-53

[4]徐冬英．药用蕨类植物的研究进展[J].中医药信息,1997(4):20-21 [5]戴锡玲,李新国,张莹．药用蕨类植物资源研究及其开发利用[J].资源开发与市场,2003,19(6):397-399

[6]陈霞,林中珍品蕨菜的开发利用[J].农产品加工,2014(4):36-37

[7]马博,苏仕林,李荣峰．蕨菜化学成分及其生物活性研究进展[J]．食品工业科技,2011,32(3):245-247

[8]李南薇,范嫒嫒,陈家生．蕨菜抑菌活性物质提取工艺优化[J]．食品科技,2012,37(5):240-243

[9]陈乃富,张莉．蕨菜黄酮类化合物的提取与分析[J]．中国林副特产,2004(6):1-4

[10]张莉,陈乃富,谷仿丽,等．蕨菜黄酮提取物免疫调节作用的实验研究[J].中国中医药科技，2009(1):33-35

[11]邬海桥,周向东．植物黄酮类的生物学特性及对呼吸系统疾病的影响[J].国际中医药杂志,2007,29(4): 223-226

[12]童红莉,田亚平.黄酮类化合物药理作用研究进展[J].按摩与康复医学,2011(24):80-82

[13]陈乃富．蕨菜黄酮类化合物的提取及其抗氧化作用[J]．食品与发酵工业,2003,29(11):63-66

[14]吴瑞宁,黄慰生,蔡建秀．泉州地区蕨类植物中总黄酮的测定[J]．福建化工,2003,15(2):15-21

[15]卢文芸,许文琴,于锡忠,等．贵州野生蕨菜中总黄酮含量的测定与分析[J]．贵州农业科学,2012,40(5):47-49

[16]张婷婷,马博,李荣峰,等.桂西野生蕨菜黄酮提取工艺优化研究[J]．北方园艺,2013(16):163-165

[17]李冬梅,李莉,吴五谊,等.正交试验法优选云南松松塔总黄酮的提取工艺[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(1):37-39

[18]赖红芳,韦瑞松,黄秀香.金樱根总黄酮提取工艺优选[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(3):13-15

[19]刘向鸿,侯大彬,赵纳,等．九眼独活类黄酮的提取和抗氧化活性研究[J]．中药材,2010,33(9):1485-1487

[20]刘娟,李楠,王昌涛．牡丹花粉黄酮的提取及抗氧化性研究[J]．食品研究与开发,2012,33(10):39-44

[21]王锐,何嵋,袁晓春,等.桑葚多糖体外清除自由基活性研究[J]．安徽农业科学,2012,40(2):775-776,779

[22]李利华,夏冬辉.山楂总黄酮的超声波辅助提取及抗氧化性能研究[J]．中国食品添加剂,2014(5):94-99

[23]王姝涵,李玉桃,孙墨珑．兴安杜鹃总黄酮抗氧化活性[J]．湖北农业科学,2014,53(8):1895-1897

[24]贾长虹,常丽新,李月,等．月季叶黄酮对自由基和亚硝酸盐的清除作用研究[J]．食品工业科技,2010,31(9):104-106

[25]赵成刚,瞿伟菁．西红花花瓣总黄酮提取及抗氧化性研究[J]．食品研究与开发,2013,34(2):29-33

Extraction Technology and Antioxidation of Total Flavonoids from Wild P.aquilinum in Dali

CHU Wei-wei，ZHANG Ye*，DUAN Xiao-mei，JIANG Chun-yan，ZHANG Hu
（Pharmacy and Chemistry College，Dali University，Dali 671000，Yunnan，China）

Abstract：Total flavonoids was extracted by ethanol reflux method using wild P.aquilinum in Dali as the raw material. Total flavonoids yield was used as the index，the extraction process was optimized by the orthogonal designing，and the antioxidant activities and reducing power of the total flavonoids were evaluated by thebook=53,ebook=60antioxidant test in vitro. The results showed that the optimal conditions were：50 % ethanol solvent，1∶50（g/mL）as the ratio of solid-liquids，extraction temperature 80℃，and about 1h extraction time. With the optimal conditions，the total flavonoids yield was 10.33 %，the reducing power and the scavenging effects of flavonoids on superoxide anion free radical and hydroxyl radical were positively correlated with the concentration of the flavonoid extraction. As the concentration was 0.12 mg/mL，the scavenging effects of the total flavonoids on the superoxide anion free radical and hydroxyl radical were 64.72 % and 57.53 %，respectively.

Key words：wild Pteridium aquilinum；total flavonoids；extraction process；orthogonal test；antioxidative activity

收稿日期：2014-12-25

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.02.013

*通信作者：张烨（1970—），男（汉），副教授，硕士，从事医用化学研究工作。

作者简介：储维维（1993—），女（汉），本科，研究方向：药物制剂工程。

基金项目：大理学院大学生科研基金项目（KYSX2014053）