徐羽中，陈群蓉，孙顺昌△，彭运生

(广东省深圳市宝安区人民医院:1.检验科；2.输血科　518101)



·论著·

应用实时荧光定量PCR技术分析UGT1A1基因启动子区A(TA)nTAA多态性

徐羽中1，陈群蓉2，孙顺昌1△，彭运生1

(广东省深圳市宝安区人民医院:1.检验科；2.输血科518101)

摘要:目的建立实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术检测尿苷二磷酸葡糖醛酸基转移酶1A1(UGT1A1)基因启动子区A(TA)nTAA序列多态性的方法。方法以16例Gilbert综合征患者和66例健康对照个体为研究对象，抽提基因组DNA，通过DNA测序确定UGT1A1基因启动子区A(TA)nTAA序列多态性。同时，设计1对引物和2条TaqMan MGB探针，2条探针的5′端分别标记FAM和VIC染料，探针的3′端则均以MGB修饰。使用实时荧光定量PCR方法扩增并检测研究对象的UGT1A1基因启动子区A(TA)nTAA多态性序列，与测序法比较，验证实时荧光定量PCR方法的灵敏度和特异度。结果应用荧光定量PCR技术检测，16例Gilbert综合征患者的UGT1A1基因启动子区A(TA)nTAA多态性序列均为A(TA)7TAA，46例健康对照个体A(TA)nTAA多态性序列为A(TA)6TAA，其余20例健康对照个体A(TA)nTAA多态性序列为A(TA)6TAA/A(TA)7TAA杂合多态性。上述结果与DNA测序结果完全一致。结论通过实时荧光定量PCR技术检测UGT1A1基因启动子区A(TA)nTAA序列多态性的方法具有灵敏度高、特异度强及操作简单等特点，可在临床推广应用。

关键词:UGT1A1基因；多态性；实时荧光定量PCR

尿苷二磷酸葡糖醛酸基转移酶1A1(UGT1A1)是催化胆红素转变为葡糖醛酸胆红素的关键酶之一[1]。UGT1A1酶是UGT1A1基因的编码产物，UGT1A1基因突变会导致血清胆红素升高，依据胆红素升高程度由低到高分别命名为Gilbert综合征(20～60 μmol/L)、Ⅰ型Crigler-Najjar综合征(>60～340 μmol/L)、Ⅱ型Crigler-Najjar综合征(>340 μmol/L)[2]。Gilbert综合征是以间歇性非溶血性黄疸为病理特征的良性遗传性疾病，患者血清胆红素轻度升高，其临床表现为长期间歇性黄疸[3]。在UGT1A1基因启动子中存在A(TA)nTAA微卫星多态性，其中(TA)重复拷贝数越多，UGT1A1酶活性越低[4]。A(TA)6TAA和A(TA)7TAA是人群中两种常见多态性，非洲人群偶见A(TA)5TAA多态性，高家索人群偶见A(TA)8TAA多态性。在中国人群中仅发现A(TA)6TAA和A(TA)7TAA两种多态性序列[5]。研究发现A(TA)nTAA多态性与伊立替康(irinotecan)、阿扎那韦(atazanavir)等药物的不良反应有关，群体遗传学研究还显示美国籍非洲人群中A(TA)7TAA多态性与乳腺癌的易患性存在相关[6]。因此，UGT1A1基因启动子A(TA)nTAA多态性检测在临床具有重要的意义。本研究将试图建立检测A(TA)nTAA多态性的实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术。

1资料与方法

1.1一般资料选择2009年10月至2013年4月在本院就诊的16例Gilbert综合征患者，其中男9例，女7例，年龄15～46岁。Gilbert综合征诊断依据包括临床表现、实验室检查及基因突变分析。诊断标准为临床出现间歇性非溶血性黄疸、升高的胆红素以游离胆红素为主、排除肝胆疾病、排除溶血因素、检测到UGT1A1基因突变。选择同期健康体检的66例健康者，其中男36例，女30例，年龄18～56岁。所有研究对象的UGT1A1基因启动子中A(TA)7TAA多态性序列通过PCR扩增并测序确定，具体方法见文献[7]。本研究经过医院伦理委员会批准，所有研究对象均被告知研究内容，并同意参与本研究。研究对象的基因组DNA为-30 ℃冰箱保存的经苯酚-氯仿抽提制备的基因组DNA。

1.2方法

1.2.1仪器实时荧光定量PCR仪为LightCycler 480Ⅱ扩增仪(瑞士罗氏诊断公司制造)。

1.2.2引物及探针设计在UGT1A1基因(GenBank NM_000463.2)启动子区及外显子1上设计1对引物，扩增基因的启动子区及外显子1的部分序列。上游引物序列为5′-CAT TAA CTT GGT GTA TCG ATT GGT-3′，下游引物序列为5′-AGC AGG CCC AGG ACA AGT-3′。与A(TA)6TAA序列杂交的探针1序列为FAM-TTG CCA TAT ATA TAT ATA TAA GTA GGA-MGB，与A(TA)7TAA序列杂交的探针2序列为VIC-TGC CAT ATA TAT ATA TAT ATA AGT AGG A-MGB，其中FAM与VIC为荧光染料，探针3′ 端以小沟聚合物(MGB)修饰。引物合成、探针合成及修饰均由上海基康生物技术有限公司完成。扩增片段长度为132 bp [A(TA)6TAA]或134 bp[A(TA)7TAA]。

1.2.3实时荧光定量PCR检测PCR反应在96孔反应板中进行，反应总体积为50 μL 。反应体系含75 mmol/L Tris-HCl (pH8.8)、20 mmol/L (NH4)2SO4、0.01%吐温20、3.0 mmol/L MgCl2、0.5 mmol/L dNTPs、0.2 μmol/L引物/条、0.2 μmol/L探针/条、0.4 U Taq DNA聚合酶、100 ng基因组DNA。PCR扩增程序为首先95 ℃变性5 min，然后进入40个扩增循环，每一循环包括95 ℃变性15 s，60 ℃杂交1 min，荧光采集模式设为60 ℃单点采集。结果分析模式为终点基因分型，X轴为FAM荧光强度，Y轴为VIC荧光强度。

1.2.4方法学评价读取实时荧光定量PCR检测的A(TA)nTAA多态性结果，并与以前的测序结果进行比较，探讨实时荧光定量PCR检测A(TA)nTAA多态性的灵敏度和特异度。

2结果

2.1实时荧光定量PCR技术能检测分型A(TA)nTAA多态性通过实时荧光定量PCR技术，本研究标本全部成功扩增。终点基因分型法显示，16例Gilbert综合征患者的UGT1A1基因启动子区A(TA)nTAA多态性序列均为A(TA)7TAA，46例健康者A(TA)nTAA多态性序列为A(TA)6TAA，其余20例健康者A(TA)nTAA多态性序列为A(TA)6TAA/A(TA)7TAA杂合多态性序列。实时荧光定量PCR技术能分型全部个体UGT1A1基因启动子区的A(TA)nTAA多态性序列。

2.2实时荧光定量PCR技术分型A(TA)nTAA多态性具有高的灵敏度和特异度通过实时荧光定量PCR技术，16例Gilbert综合征患者和66例健康者UGT1A1基因启动子区A(TA)nTAA多态性序列均被成功检测，与测序一致，检测灵敏度达100%。通过与测序结果比较，实时荧光定量PCR技术分型检测UGT1A1基因启动子区A(TA)nTAA序列多态性的结果与DNA测序结果完全相符，且3种基因型散点图分布在3个明显不同区域，每一区域的点较为集中，因此实时荧光定量PCR技术分型检测A(TA)nTAA多态性的特异度达100%。

3讨论

在UGT1A1基因启动子中存在A(TA)nTAA微卫星多态性，基因中TA重复序列拷贝数越多，UGT1A1酶活性越低，研究显示TA重复序列每增加1个拷贝，UGT1A1酶活性就降低30%[8]。伊立替康、氟尿嘧啶与亚叶酸联合用药是目前临床治疗转移性结肠癌、直肠癌的一线药物，伊立替康在治疗过程中有时会出现骨髓抑制和迟发性腹泻等不良反应，这些不良反应与个体UGT1A1基因启动子中A(TA)nTAA多态性存在相关[9]。研究显示UGT1A1基因启动子中携带(TA)7TAA的个体比携带(TA)6TAA个体更能耐受阿扎那韦治疗导致的黄疸[10]。群体遗传学研究显示在美国籍非洲人群中，UGT1A1基因启动子中携带A(TA)7TAA多态性序列个体的乳腺癌易患性增加[11]。因此UGT1A1基因启动子中A(TA)nTAA多态性检测在临床具有重要意义。

A(TA)nTAA多态性属于短串联重复序列(STR)，传统检测方法有单链构像多态性分析、变性梯度凝胶电泳、毛细管电泳、变性高效液相色谱等[12]。这些检测技术各有自身的特点，但也存在一些缺陷，如检出率不高、假阳性率高、检测通量低、实验技术要求高、实验时间较长、检测成本高等，因此难以用于临床检测。微卫星多态性检测新方法有侵入探针分析法和高分辨率熔解曲线分析法。侵入探针分析法是一种等温的定性或定量检测技术，操作简单，但灵敏度较低[13]。高分辨率熔解曲线分析是一种高效稳定的PCR检测技术，操作简便快速，成本低，已广泛应用于检测单核苷酸多态性，但它检测微卫星多态性分辨率不高[14]。

TaqMan探针技术已成为一种经典的定量PCR技术，特异度强，灵敏度高，既可用于定量分析，又可用于定性检测[15]。TaqMan探针技术检测关键在于合成探针及引物，这给检测特定位点序列变异、微卫星多态性序列变异带来困难。在中国人群中UGT1A1基因启动子区A(TA)nTAA多态性序列包括A(TA)6TAA和A(TA)7TAA，用TaqMan探针技术区分它们需设计一对引物和两条探针，且探针覆盖A(TA)nTAA序列。本研究首先设计与A(TA)7TAA序列杂交的探针2：5′-TGC CAT ATA TAT ATA TAT ATA AGT AGG A-3′，为了使2条探针的退火基本一致，设计与A(TA)6TAA序列杂交的探针1时，本研究在探针的5′端延伸了一个T碱基，因此探针1为5′-FAM-TTG CCA TAT ATA TAT ATA TAA GTA GGA-MGB-3′。普通荧光定量PCR TaqMan探针的Tm一般需高于引物的Tm值10 ℃左右，若目标区域(A+T)%含量高，往往达不到10 ℃左右Tm差值的要求[16]。若延长探针长度，又难以区分A(TA)6TAA和A(TA)7TAA序列，3′ 端标记MGB可提高探针的Tm值，故本研究的探针3′ 端以MGB标记。两条探针的5′ 端依据一般实进荧光定量PCR仪激发波长范围分别标记荧光染料FAM与VIC。本研究关键在于成功设计了扩增UGT1A1基因启动子区A(TA)nTAA多态性序列的探针及引物，并在探针3′端使用MGB修饰，使探针尤其适合检测富含AT重复序列。目前临床检测病原性微生物的基因扩增技术基本都采用了实时荧光定量PCR技术，并且同一厂家的大多数试剂盒共用一个检测程序，极大简化了临床检测。本研究使用实时荧光定量PCR技术检测A(TA)nTAA多态性，可与病原性微生物基因检测同步进行，检测方便，具有临床应用价值。

参考文献

[1]Sato H，Uchida T，Toyota K，et al.Association of neonatal hyperbilirubinemia in breast-fed infants with UGT1A1 or SLCOs polymorphisms[J].J Hum Genet,2015,60(1):35-40.

[2]Horsfall LJ，Hardy R，Wong A，et al.Genetic variation underlying common hereditary hyperbilirubinaemia (Gilbert′s syndrome) and respiratory health in the 1946 British birth cohort[J].J Hepatol，2014，61(6)：1344-1351.

[3]Chen Z，Su D，Ai L，et al.UGT1A1 sequence variants associated with risk of adult hyperbilirubinemia：a quantitative analysis[J].Gene，2014，552(1)：32-38.

[4]Kim KP，Hong YS，Lee JL，et al.A phase I study of UGT1A1 *28/*6 genotype-directed dosing of irinotecan (CPT-11) in Korean patients with metastatic colorectal cancer receiving FOLFIRI[J].Oncology，2015，88(3)：164-172.

[5]Hsieh TY，Shiu TY，Chu NF，et al.Rapid molecular diagnosis of the Gilbert′s syndrome-associated exon 1 mutation within the UGT1A1 gene[J].Genet Mol Res，2014，13(1)：670-679.

[6]Ehmer U，Kalthoff S，Fakundiny B，et al.Gilbert syndrome redefined：a complex genetic haplotype influences the regulation of glucuronidation[J].Hepatology，2012，55(6)：1912-1921.

[7]孙顺昌，周指明，陈群蓉，等．未结合型高胆红素血症患者UGT1A1基因的突变分析[J]．中华医学遗传学杂志，2013，30(4)：425-428．

[8]Warang P，Devendra R，D′silva S，et al.Do UGT1A1 and HMOX1 gene promoter polymorphisms increase the risk of hyperbilirubinemia and gallstones in patients with hereditary spherocytosis[J].Ann Hematol，2015，94(1)：169-171.

[9]Yamasaki S，Tanimoto K，Kohno K，et al.UGT1A1 *6 polymorphism predicts outcome in elderly patients with relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma treated with carboplatin，dexamethasone，etoposide and irinotecan[J].Ann Hematol，2015，94(1)：65-69.

[10]Zhang X，Ao G，Wang Y，et al.Genetic variants and haplotypes of the UGT1A9，1A7 and 1A1 genes in Chinese Han[J].Genet Mol Biol，2012，35(2)：428-434.

[11]Travan L，Lega S，Crovella S，et al.Severe neonatal hyperbilirubinemia and UGT1A1 promoter polymorphism[J].J Pediatr，2014，165(1)：42-45.

[12]Kutanan W，Kitpipit T，Phetpeng S，et al.Forensic STR loci reveal common genetic ancestry of the Thai-Malay Muslims and Thai Buddhists in the deep Southern region of Thailand[J].J Hum Genet，2014，59(12)：675-681.

[13]Faltin B，Zengerle R，Von Stetten F.Current methods for fluorescence-based Universal sequence-dependent detection of nucleic acids in homogenous assays and clinical applications[J].Clin Chem，2013，59(11)：1567-1582.

[14]Minucci A，Mello E，Tripodi D，et al.High resolution melting analysis (HRMA) for the identification of a rare UGT1A1 promoter polymorphism[J].Clin Biochem，2011，44(16)：1359-1360.

[15]Mo QH，Wang HB，Tan H，et al.Comparative detection of rotavirus RNA by conventional RT-PCR，TaqMan RT-PCR and real-time nucleic acid sequence-based amplification[J].J Virol Methods，2015，213(1)：1-4.

[16]Mingxiao M，Jinhua L，Yingjin S，et al.TaqMan MGB probe fluorescence real-time quantitative PCR for rapid detection of Chinese Sacbrood virus[J].PloS one，2013，8(2)：e52670.

作者简介：徐羽中，女，主管技师，主要从事分子诊断研究。 △通讯作者，E-mail：shunchangsun@aliyun.com。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.13.023

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)13-1806-03

(收稿日期：2016-01-27修回日期：2016-04-08)

Analysis on A(TA)nTAA polymorphism of UGT1A1 gene promoter by fluorescence real-time quantitative PCR

XUYuzhong1,CHENQunrong2，SUNShunchang1△，PENGYunsheng1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory;2.DepartmentofBloodTransfusion,BaoanDistrictPeople′sHospital,Shenzhen,Guangdong518101，China.)

Abstract:ObjectiveTo develop a new method to detect A(TA)nTAA polymorphism in the UGT1A1 gene promoter by fluorescence real-time quantitative PCR (RQ-PCR).MethodsGenomic DNA was extracted from peripheral blood in 16 patients with Gilbert′s syndrome and 66 healthy individuals.The polymorphic A(TA)nTAA sequence in the UGT1A1 gene promoter was determined by DNA sequencing.A pair of primers and two TaqMan probes labeled with either 5′ FAM or VIC reporter dye incorporated a 3′ minor groove binder were designed.The A(TA)nTAA polymorphisms in the UGT1A1 gene promoter were identified by RQ-PCR for all research subjects.The sensitivity and specificity of RQ-PCR for detecting the A(TA)nTAA polymorphisms were verified by DNA sequencing method.ResultsThe homozygous A(TA)7TAA polymorphism was found in the promoter region of the UGT1A1 gene in all 16 patients with Gilbert′s syndrome by using RQ-PCR.The homozygous A(TA)6TAA polymorphism was found in 46 healthy subjects,while the heterozygous A(TA)6TAA/A(TA)7TAA polymorphism was found in other 20 healthy subjects.All A(TA)nTAA polymorphisms in the promoter region of the UGT1A1 gene identified by RQ-PCR were consistent with that of DNA sequencing.ConclusionIt is a sensitive,specific and simple method to detect the A(TA)nTAA polymorphisms in the promoter region of the UGT1A1 gene by RQ-PCR,which can be promoted and applied in clinic.

Key words:UGT1A1 gene;polymorphism;fluorescence real-time quantitative PCR