庞舒尹，陈奕豪，刘海英△，陈曲波，蔡　莉，彭小芳，高　飞，代玉梅，刘云锋

(1.广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心检验科，广州 510000；2.广东省中医院医学资源中心，广州 510000；3.广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心体检中心，广州 510000)



·论著·

儿童抗核抗体不同稀释度检测结果分析*

庞舒尹1，陈奕豪1，刘海英1△，陈曲波2，蔡莉3，彭小芳1，高飞1，代玉梅1，刘云锋1

(1.广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心检验科，广州 510000；2.广东省中医院医学资源中心，广州 510000；3.广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心体检中心，广州 510000)

摘要:目的比较不同血清稀释滴度对儿童抗核抗体间接免疫荧光分析(ANA-IIF)结果的影响，探讨降低血清起始稀释度必要性。方法以间接免疫荧光法检测110例健康儿童系列稀释度血清标本抗核抗体(ANA)，并与特异性ANA线性免疫(ANA-LIA)结果相比较；同时分析一组ANA-IIF阴性的临床患儿标本ANA-LIA结果。结果健康组标本随着稀释度从1∶80、1∶40、1∶20逐步减低，ANA-IIF阳性检出率有所上升，分别为7.3%、9.1%、10.9%，但差异无统计学意义(P>0.05)，弱阳性分别为7.3%、15.5%、31.8%，差异有统计学意义(P<0.01)。110例健康体检儿童中8例标本检测出特异性ANA，阳性率为7.3%。8例IIF法稀释度1∶80阳性者中，特异性ANA阳性者2例；稀释度1∶40、1∶20新增的4例荧光ANA阳性标本中，有1例特异性ANA阳性。若视ANA-IIF(1∶80)或ANA-LIA任一阳性为ANA阳性，ANA阳性率从7.3%上升到12.7%。29例ANA-IIF(1∶80)为阴性的自身免疫肝病相关自身抗体检测患儿临床标本中，特异性ANA-LIA检测出5例阳性(17.2%)。结论降低儿童血清起始滴度并不能明显提高ANA-IIF阳性检出率，反而增加了非特异的弱阳性，因此，临床实验室不需改变儿童ANA常规标本稀释滴度，联合特异性ANA-LIA的检测有利于ANA的发现。

关键词:抗核抗体；儿童；间接免疫荧光分析；自身免疫性肝病

抗核抗体(ANA)是风湿免疫病诊断、疗效监测和预后的重要指标，在临床医疗工作中发挥着越来越重要的作用。以HEp-2细胞为基质的间接免疫荧光分析(IIF)则为临床上最为常用的ANA初筛方法。自身抗体检测一般都需要采用稀释血清，只有在一定的稀释度上的阳性结果才具有临床参考意义，尤其是IIF，其阳性滴度越高，越表明自身免疫性疾病的可能。传统系统的ANA滴度达1∶160阳性才被视为具有诊断意义，而1∶80滴度阳性往往很少发现有诊断相关的特异性ANA，从而被作为临界线，相应地，临床上将血清1∶80稀释度当作ANA筛查的起始稀释度[1]。因此，ANA的起始稀释度直接决定了结果的阴阳，影响着临床的判断。目前，ANA的标本稀释度一般是建立在成人数据基础之上，这个工作稀释度是否适用于儿童人群有待研究。大多数儿童自身免疫性疾病发生在3～13岁，该年龄段包括免疫系统在内各个系统尚处于发育成熟过程。以自身抗体常见的免疫球蛋白亚类IgG为例，其血液浓度在5岁时只达到成人的一半，8岁时为80%，13岁以后才接近成人水平[2-3]。众多临床医生怀疑，对于自身免疫性疾病患儿，其血清滴度并不能以成人的水平去要求，于是有人提出在临床高度疑似患儿，如常规稀释度(1∶80或1∶40)为阴性时，可降低稀释度，有些还被纳入疾病诊断标准中，如儿童自身免疫性肝炎，在其简化积分制诊断标准中将ANA阳性滴度降为1∶20[4-5]。尽管目前没有研究数据证明降低稀释度究竟能有多大幅度提高诊断阳性率，在实际工作中，也没有评估过降低稀释度对由于非特异染色增高而影响结果判断、带来假阳性的负面干扰[6]。本研究拟采用健康体检的正常儿童血清标本进行不同稀释度的ANA检测，并结合特异性ANA的线性免疫分析，以探讨为提高儿童ANA检测灵敏度而降低工作起始稀释度的必要性。

1资料与方法

1.1一般资料(1)健康组为3～13岁、半年内无疫苗接种、无病毒感染史的学校统一体检或门诊健康体检儿童110例，以1岁为1个年龄段，每个年龄段男女各5例，排除患有系统性红斑狼疮、幼年特发性关节炎、川崎病、脉管炎、肾炎、干燥综合征、硬皮病、重症肌无力、幼年皮肌炎、多发性皮肌炎、混合结缔组织病、韦格纳肉芽肿等自身免疫性疾病以及发热、关节疼痛等风湿免疫相关临床症状。抽取清晨空腹静脉血，按常规方法离心分离血清，剔除有明显浑浊、黄疸、溶血等标本。按时检测，体检标本则在常规检测完毕后，及时分装剩余血清储于-70 ℃待用。每个标本进行ANA-IIF和特异性ANA线性免疫(ANA-LIA)，试剂盒均购自德国欧蒙实验诊断公司。(2)观察组为住院或门诊进行自身免疫性肝病相关自身抗体检测的患儿标本，其中自身免疫性肝病相关自身抗体均为阴性的29例标本。

1.2ANA-IIF筛查采用包含HEp-2细胞和鼠肝组织冰冻切片等2种抗原基质。遵循试剂盒说明书的血清标本起始稀释度，按照操作步骤进行实验。结果判读采用试剂盒说明书推荐的定性判断，细胞核无特异性荧光视为阴性，有弱的特异性荧光模型为弱阳性，呈现中等强度清晰可辨的荧光模型时则为阳性，呈现强荧光模型为强阳性。根据核型的荧光强弱，检测结果报告为弱阳性、阳性或强阳性。除常规检测外，另采用试剂盒标本稀释液对血清进行系列稀释(1∶20，1∶40，1∶80)，之后操作、判断均同前述。

1.3特异性ANA-LIA采用可同时检测12种常见特异性抗体(nRNP/Sm、Sm、SS-A、Ro-52、SS-B、Scl-70、Jo-1、CENP B、dsDNA、核小体、组蛋白、核糖体P蛋白)膜条。按照试剂盒说明书进行实验操作和检验结果解释判断，在相应抗原线处出现明显蓝紫色条带为阳性反应，根据抗原带着色的深浅将结果报告为阴性、临界阳性(弱阳性)、阳性、强阳性。

1.4统计学处理采用SPSS16.0软件进行统计分析，健康体检者不同稀释滴度阳性检出率的比较采用R×C表的χ2检验，两组间率的比较则采用四格表Pearson或Fisher′s精确χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1健康组ANA-IIF检测结果110例健康体检儿童中，血清稀释滴度为1∶80时，阳性8例(颗粒型、核仁型各4例)，弱阳性8例(颗粒型1例、胞浆颗粒型7例)；稀释滴度为1∶40时，阳性10例(颗粒型5例、核仁型4例、胞浆颗粒1例)，弱阳性17例，新增9例弱阳均为胞浆颗粒型；稀释滴度为1∶20时，阳性12例(颗粒型5例、核仁型4例、胞浆颗粒3例)，弱阳性35例，新增19例弱阳胞浆颗粒型。标本随着稀释度从1∶80、1∶40、1∶20逐步提高，阳性检出率分别为7.3%(8/110)、9.1%(10/110)、10.9%(12/110)，差异无统计学意义(χ2=0.88，P>0.05)，而弱阳性的检出率分别为7.3%(8/110)、15.5%(17/110)、31.8%(35/110)，差异有统计学意义(χ2=23.1，P<0.01)。

2.2健康组ANA-LIA检测结果110例健康体检儿童中8例标本检测出特异性ANA，阳性率为7.3%，具体为抗组蛋白2例、抗dsDNA 2例、抗nRNP 1例、抗Sm 1例、抗SSB 1例、抗Ro-52 1例。8例IIF法稀释度1∶80阳性者中，特异性ANA阳性者2例(颗粒型/抗组蛋白、核仁型/抗组蛋白)；稀释度提高的1∶40、1∶20新增的4例阳性标本中，仅有1例1∶20胞浆颗粒阳性/抗nRNP；其余IIF阳性者特异性ANA均为阴性，余下5例特异性ANA阳性者其IIF法在不同稀释度呈弱阳性。若视IIF法1∶80或特异性ANA任一阳性为ANA阳性，则阳性检出率从7.3%上升到12.7%，差异无统计学意义(χ2=3.655，P>0.05)。

2.3观察组线性免疫检测结果29例IIF-ANA 1∶80为阴性的临床患儿标本中，特异性ANA-LIA检测出5例阳性(17.2%)，分别为抗-组蛋白1例、抗dsDNA 1例、抗SSA 2例、抗核糖体P蛋白 1例。

3讨论

无论是1999年积分诊断系统，还是2008年简化诊断标准，ANA一直被纳为自身免疫性肝病(AIH)诊断中的一项重要积分依据[4-5]。50%～70%的Ⅰ型AIH患者ANA阳性，均质型、斑点型为AIH最为常见的荧光模型，但都不具备AIH特异性，目前为止尚未发现特异性ANA，其主要靶抗原为单链DNA(57%～85%)、双链DNA(0～50%)、组蛋白(25%～40%)、染色质(39%)、核糖体核蛋白(20%～58%)等。Ⅰ型AIH中ANA阳性率70%，其中与SMA共同阳性60%，另有15%仅为ANA阳性[7]。ANA滴度对可疑患者是可能或确定的AIH诊断积分有用。ANA也在其他肝脏疾病中存在，如病毒性肝炎、药物性肝炎、酒精性肝病、肝细胞肝癌以及某些肝外疾病。抗Ro52在Ⅰ型AIH中阳性率达77%[7]。

ANA最常用以及最常规的方法是大鼠肝、肾、胃组织的冰冻切片，筛查方法可为HEp-2细胞基质片，而诊断积分则组织切片的价值要高。AIH诊断的积分系统是否适用于儿童AIH的诊断标准，有学者提议了专门用于儿童AIH诊断标准，采用了基于包括临床、生化、免疫和组织学的积分系统，其中自身抗体滴度要比成人低1个稀释度，如成人ANA或SMA临界值为1∶40，而儿童则为1∶20[8-9]。尽管如此，有研究评价得到现用的简化标准其灵敏度低而特异性稍高。美国临床和实验室标准协会提出，对于IIF，在每个实验室建立自己的参考区间后，应以适当的质控和参考物确立筛查稀释度；并且，结果分析需综合荧光模型、抗体水平和患者年龄。老年人，尤其女性，易于产生低滴度(低于1∶80)的自身抗体但没有临床自身免疫性疾病症状，而对于年幼患者，筛查稀释度可降至1∶40[10]。

IIF筛查稀释度的高低与试验特异性、敏感性存在辩证关系，非特异荧光干扰随血清稀释度减小而增加，当筛查稀释度越大时，敏感性降低而特异性增加，当稀释度越小，敏感性增加但特异性降低。因此，排除不必要的非特异干扰，实验室必须确定正确的稀释度，在大多数健康人群血清标本检测时呈阴性结果，又能保证患者群众最低稀释度的特异性自身抗体，对阳性结果判断和平衡敏感性、特异性方面具有重要价值。本研究比较了健康儿童不同稀释滴度的IIF检测结果，显示随着稀释度的提高，阳性检出率从7.3%提高到10.9%，差异无统计学意义(P>0.05)；但是，由稀释度提高导致弱阳性的胞浆颗粒染色而导致非特异干扰却明显加强(31.8%)。因此，提高患儿ANA检测稀释度，提高阳性检出率有限，反而大大增加了结果观察的干扰。

当然，儿童免疫系统发育尚未完全，血循环免疫球蛋白水平与成人有一定差距，这也是降低稀释滴度提高阳性检出率的客观依据。但是，这并不是提高ANA阳性检出率、避免漏诊的唯一手段。近年来，随着研究的不断深入，ANA所针对的靶抗原逐一得到鉴别，在其基因工程重组抗原基础上发展了灵敏度更高、特异性更强的特异性ANA检测方法，如酶免疫测定(EIA)、LIA。ANA特异性抗体的EIA法可自动化、成本效益比高，是国外实验室首选方法。LIA因技术、设备要求低、可肉眼判断结果，在我国应用较为广泛。特异性ANA检测是IIF的补充，许多IIF阴性患者，其特异性ANA可检出阳性。因此对于临床疑似AID的患者，无论ANA初筛试验阴性与否，均需进行各种针对特异性抗体的确认试验，但是各种特异性抗体的确认试验不能完全替代筛查试验。当然这也与IIF-ANA选取的基质有关，如果选用转染了Ro60 cDNA的HEp-2000细胞为基质则可提高检测灵敏度，从而减少IIF-ANA阴性与LIA-ANA阳性不符的发生。在健康组LIA-ANA阳性率与IIF-ANA一致，不过阳性者不完全重叠，而29例临床标本IIF-ANA为阴性的患儿中，17.2% LIA-ANA阳性。因此研究提示，不需提高抗体滴度，增加特异性ANA的检测也可以提高ANA的阳性检出率，这点也符合ANA检测中“临床高度怀疑时无论ANA结果如何，建议医生申请ENA特异性抗体检测”国内外专家共识及建议。

参考文献

[1]Sack U,Conrad K,Csernok E,et al.Autoantibody detection using indirect immunofluorescence on HEp-2 cells[J].Ann N Y Acad Sci,2009,1173(14):166-173.

[2]Jiang ZY,Yf L,Guan QH,et al.Detection and reference interval determination for serum immunoglobulin of 1-8 years old children of Guangzhou[J].J Trop Med,2009,9(11):1259-1261.

[3]Coffin CM,Hamilton MS,Pysherc TJ,et al.Pediatric laboratory medicine:Current challenges and future opportunities[J].Am J Clin Pathol,2002,117(5):683-690.

[4]Alvarez F,Berg PA,Bianchi FB,et al.International autoimmune hepatitis group report:review of criteria for diagnosis of autoimmune hepatitis[J].J Hepatol,1999,31(5):929-938.

[5]Hennes EM,Zeniya M,Czaja AJ,et al.Simplified criteria for the diagnosis of autoimmune hepatitis[J].Hepatology,2008,48(1):169-176.

[6]Mieli-Vergani G,Vergani D.Paediatric autoimmune liver disease[J].Arch Dis Child,2013,98(12):1012-1017.

[7]Liberal R,Grant CR,Longhi MS,et al.Diagnostic criteria of autoimmune hepatitis[J].Autoimmun Rev,2014,13(4/5):435-440.

[8]Mieli-Vergani G,Heller S,Jara P,et al.Autoimmune hepatitis[J].J Pediatr Gastroenterol Nuri,2009,49(10):158-164.

[9]Hiejima E,Komatsu H,Sogo T,et al.Utility of simplified criteria for the diagnosis of autoimmune hepatitis in children[J].J Pediatr Gastroenterol Nutr,2011,52(4):470-473.

[10]Agmon-Levin N,Damoiseaux J,Kallenberg C,et al.International recommendations for the assessment of autoantibodies to cellular antigens referred to as anti-nuclear antibodies[J].Ann Rheum Dis,2014,73(1):17-23.

*基金项目：广东省广州市卫生局西医类重点项目(201102A212023)。

作者简介：庞舒尹，女，技师，主要从事临床医学检验工作。 △通讯作者，E-mail：xiangliuhaiying@aliyun.com。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.13.010

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)13-1772-03

(收稿日期：2016-02-10修回日期：2016-04-22)

Analysis on detection results of different dilution titers of antinuclear antibodies in children*

PANGShuyin1,CHENYihao1,LIUHaiying1△,CHENQubo2,CAILi3,PENGXiaofang1,GAOFei1,DAIYumei1,LIUYunfeng1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedGuangzhouMunicipalWomenandChildren′sMedicalCenter,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510000,China;2.MedicalResourceCenter,GuangdongProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou,Guangdong510000,China;3.MedicalExaminationCenter,AffiliatedGuangzhouWomenandChildren′sMedicalCenter,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510000,China)

Abstract:ObjectiveTo compare the influences of different dilution titers on the ANA detection by the indirect immunofluorescence assay(IIF) in children for investigating the necessity of reducing serum initial dilution titer.MethodsSerum ANA was detected by using the indirect immunofluorescence assay at a serial of dilution titer in 110 healthy controls and the results were compared with the results of specific ANAs by the linear immunoassay (LIA);meanwhile the ANA-LIA results in clinical children patients with ANA-IIF negative were also analyzed.ResultsWith the dilution titers gradual decrease from 1∶80,1∶40 and 1∶20 in the samples of the health group,the positive detection rates of ANA-IIF were risen,which were 7.3%,9.1% and 10.9% respectively,but the differences were not statistically significant(P>0.05),the weak-positive rates were 7.3%,15.5% and 31.8% respectively,the differences were statistically significant(P<0.01).Among 110 healthy children under going the physical examination,the specific ANA was detected out in 8 samples,the positive rate was 7.3%.Among 8 positive cases at the dilution titer of 1∶80 by the IIF method,specific ANA was in 2 cases;in 4 added cases of fluorescence ANA positive samples at the dilution titers of 1∶40 and 1∶20,specific ANA was in 1 case.If with any positive of ANA-IIF(1∶80) or ANA-LIA as the ANA positive,the ANA positive rate was risen from 7.3% to 12.7%.In the clinical samples among 29 cases of ANA-IIF(1∶80) negative autoimmune liver disease related autoantibody detection,the specific ANA-LIA positive was detected in 5 cases (17.2%).ConclusionReducing the initial titer of children serum is unable to obviously increase the ANA-IIF positive detection rate,on the contrary increases the non-specific weak positive.Therefore,clinical laboratory does not change the dilution titer of children routine ANA sample.The detection by combining with the specific ANA-LIA spectrum is conducive to find ANA.

Key words:antinuclear antibodies;children;indirect immunofluorescence assay;autoimmune liver diseases