岳筠，胡兴义，唐宇，冉隆仲，李涛，王慧

(1．贵州省动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 550001;2．贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025;3．贵州省畜禽遗传资源管理站，贵州 贵阳 550001)

猪病毒性腹泻疫苗研究进展

岳筠1，胡兴义2，唐宇3，冉隆仲1，李涛1，王慧1

(1．贵州省动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 550001;2．贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025;3．贵州省畜禽遗传资源管理站，贵州 贵阳 550001)

猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒是当前猪病毒性腹泻的主要病原，临床表现主要为呕吐、水样腹泻、脱水、逐渐消瘦等症状。不同年龄和品种的猪均可感染，严重危害养猪业的健康发展。疫苗接种是防控猪病毒性腹泻的关键措施之一，但大量临床试验显示抗体阳性率低，免疫效果不佳。文章针对猪病毒性腹泻疫苗的研究进展进行综述，旨在为临床上预防猪病毒性腹泻提供参考。

猪流行性腹泻病毒;猪轮状病毒;猪传染性胃肠炎病毒;疫苗;研究进展

猪病毒性腹泻是猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virusof swine，TGEV)和猪轮状病毒(Porcine rotarvirus，PoRV)感染引起的以水样腹泻、脱水、呕吐等为主要症状的急性传染病的统称，给我国养猪业造成了巨大损失［1～3］。国内外研究报道，猪病毒性腹泻存在混合感染。自2010年以来，我国猪病毒性腹泻的发病率呈明显上升的趋势，其中PEDV感染率和病死率均最高，目前猪腹泻疫苗多为PEDV－TGEV二联灭活疫苗，世界各国预防PoRV感染主要为弱毒疫苗。就目前所知，美国PoRV弱毒疫苗、TGEV－PoRV二联弱毒疫苗及俄罗斯PEDV－TGEV－PoRV三联弱毒疫苗，其成本价高，大多规模化养猪场放弃其免疫接种。我国猪腹泻弱毒疫苗的研发一直都是薄弱环节，国内正在临床上推广应用的有TGEV－PoRV二联弱毒疫苗(中国哈尔滨兽医研究所研发)、PEDV－TGEVPoRV三联弱毒疫苗(上海海利生物技术有限责任公司生产)及PEDV－TGEV－PoRV三联弱毒疫苗(中国农业大学与福建生物药品厂联合研发)，但其抗体阳性率较低，不能较好预防猪群免受腹泻病毒的感染。我国于1995年开始用二联灭活疫苗或弱毒疫苗PEDV和TGEV的联合预防［4，5］，但从2006年开始，PEDV疫苗的免疫效果越来越差，免疫猪群依然暴发PEDV［6］。本文对目前我国猪病毒性腹泻疫苗的研究进展进行综述，以期为预防该病提供参考。

1 PEDV疫苗研究进展

当前临床上对PED的防控主要是采用疫苗接种，包括组织灭活疫苗、细胞灭活苗及弱毒疫苗等，这些疫苗在PEDV的防治中起着至关重要的作用。

1．1 灭活疫苗灭活疫苗在动物疫病防控方面发挥了非常重要的作用，其主要优点是安全性高、易于运输和保存。最早我国使用的PEDV疫苗主要是组织灭活疫苗，但其组织灭活疫苗病毒含量较低，免疫持久性不强，免疫剂量大和需多次免疫等缺点。自1988年使用添加胰酶的方法成功分离到PEDV以来，一些实验室使用Vero细胞对PEDV进行了分离，并进行传代培养，继而获得高滴度的病毒液［7］。徐宏军等［8］和苏运芳等［9］将PEDV CV777株适应Vero细胞并以第28代毒液制备PEDV和TGEV二联灭活疫苗，对PED和TGE均具有很好的免疫效果，有效控制了这2种病毒性疫病的感染。

1．2 弱毒疫苗弱毒疫苗是临床上使用较为广泛的疫苗，其优点在于能够刺激机体产生持久的免疫效价，对动物无致病性。马锐等［10］将已经适应Vero细胞的PEDV CV777连续传代到93代，削弱了该病毒株的毒力并保存了良好的免疫原性，成功制备出了我国首株流行性腹泻的弱毒疫苗。

1．3 基因工程疫苗基因工程疫苗的种类很多，主要包括重组活载体疫苗、亚单位疫苗和核酸疫苗。

1．3．1 核酸疫苗:向敏等［11］将部分具有保护抗原基因(COE基因)插入相应的载体，pIRES2－EGFP构建真核表达载体，并在Vero细胞进行表达，将重组的质粒接种小鼠并产生相应的抗体。焦茂兴等［12］利用PCR技术扩增PEDV疫苗株，并成功构建重组腺病毒穿梭质粒，与BJ5183细菌构建同源腺病毒质粒，经酶切转染转染到AD－293细胞，从而获得3个具有感染力重组腺病毒，并共同感染Vero细胞，取上清液进行小鼠免疫，共同感染Vero细胞所得蛋白能诱导小鼠产生特异性体液免疫。

1．3．2 重组活载体疫苗:当前，大多使用活载体制备重组活载体疫苗，以期达到产生黏膜免疫反应。梁恩涛等［13］将PEDV S1(1～789 aa)基因连接于真核载体表达，成功获得了重组弱毒鼠伤寒沙门氏菌株，研究发现该菌株具有较高的质粒安全性和稳定性，且口服后能够在小鼠肠道组织中进行转录，为进一步研制新型口服疫苗提供了科学依据。项林盛等［14］将PEDV S1基因克隆到腺病毒，构建的重组腺病毒能够稳定地表达PEDV S1蛋白，为PEDV口服疫苗的研究提供了新的思路。

1．3．3 亚单位疫苗:对于PED亚单位疫苗的研制，人们采用的真核表达系统有哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞表达系统。OH J等［15］利用哺乳动物细胞表达系统将PEDV S1(1～735 aa)基因在PK－15细胞中表达成功，将400 μg纯化的S1蛋白加入佐剂后注射免疫妊娠母猪，有效免受了新生仔猪PED的感染。谭博敏等［16］将PEDV S1(83～276 aa)基因插入到毕赤酵母表达载体并转化入毕赤酵母中并整合于酵母染色体中，结果表明目标蛋白能够与PEDV阳性血清发生特异性结合并保持良好的反应原性。

目前PED亚单位疫苗的研究仍处于初级阶段，不同的表达系统之间和不同的抗原片段之间有一定的差异性，疫苗不仅要求具有其免疫原性，还能够使动物产生足够的黏膜免疫，这需要更进一步的研究。

2 TGEV疫苗研究进展

TGEV疫苗大致经历了3个阶段，即灭活疫苗、弱毒疫苗和基因工程疫苗。

2．1 灭活疫苗灭活疫苗虽然可以解决场地污染问题，但其诱导的免疫应答速度较慢，不能刺激机体产生SIgA抗体，制苗成本高。贾华强等［17］利用分离的TB株制成灭活细胞苗在4个流行TGE的猪场进行田间试验，结果显示免疫母猪所产仔猪在断乳时的死亡率平均为8．5%，表明TGE细胞灭活苗具有较好的保护率，安全性高，可有效遏制TGE感染，但其研究有待进一步探索。

2．2 弱毒疫苗TGEV弱毒疫苗株主要有美国的TGE－Vac株、匈牙利的CKP株和日本的TO－163株等。大量研究得出，弱毒疫苗能刺激机体产生黏膜免疫，肌肉注射产生抗体速度快、效价高。弱毒疫苗对预防TGE的发生起到了至关重要的作用，但同样存在其他弱毒疫苗所存在的易返祖、有潜在感染危险、必须经过多次免疫才能达到良好的免疫效果等缺陷［18］。

2．3 基因工程疫苗基因工程疫苗包括重组活载体疫苗、亚单位疫苗和核酸疫苗。

2．3．1 核酸疫苗:任晓峰等［19］应用pCI新型真核融合表达载体分别表达TGEV TH－98株的全长S基因和主要抗原位点(A、B、C、D)的Sa片段。核酸疫苗既有亚单位疫苗的安全性，又有弱毒疫苗的有效性，能同时诱导机体产生体液和细胞免疫应答，符合用一种疫苗预防多种传染病的功效。

2．3．2 重组活载体疫苗:YIN J等［20］构建5个不同血清型的重组猪腺病毒，经口接种易感猪群后，免疫猪未出现临床症状，直到感染4～6 d后便从直肠棉拭子中检测到TGEV，重组病毒诱发针对TGEV的特异性病毒中和抗体，且在免疫猪的小肠、淋巴结和肺脏中检测到TGEV分泌型IgA抗体。CHEN H等［21］和LIU C等［22］将TGEV S基因的A位点和C位点插入到疫苗株鼠伤寒沙门氏菌苗的菌毛中，经口免疫BALB/c小鼠，发现诱导的抗体能识别TGEV S和N蛋白的抗原位点。

2．3．3 亚单位疫苗:亚单位疫苗中含有特殊的高分子，可以诱导机体产生抵抗病原体的免疫保护作用，从而产生良好的免疫效果。由于TGEV的S蛋白具有良好免疫原性并且在机体内有较强的抗降解能力。大量研究证明［23］，一种来自S蛋白的多肽(残基379～386)在兔体内能产生抗TGEV的综合抗体，当这些肽与第二个S蛋白的多肽(残基1 160～1 180)结合时可诱发较高滴度的抗体，但是这些肽的保护性能不能在猪体中实验。而在杆状病毒中含有4个抗原位点(A－D)的重组S蛋白的滴度与完整的S基因诱导相同，提取蛋白作为弱毒疫苗免疫妊娠母猪的加强免疫，可显著体高母猪乳汁的抗体和血清水平，从而保护新生仔猪免受TGEV的感染。

3 PoRV疫苗研究进展

近年来，许多科研工作人员对研发PoRV疫苗做了大量的探索及研发工作，综合各种科研成果，各种PoRV疫苗优缺点不一。

3．1 传统疫苗人们过去研发单价弱毒口服活疫苗，如恒河猴MMU18006，牛WC3等，其免疫持续时间效果优于灭活疫苗，但保护力不稳定，在发达国家获得较满意保护率，而在发展中国家未能获得满意保护率［24］。这种差异可能是PoRV的血清型繁多，各个地方的流行株的血清型不同。据大多数文献报道，我国PoRV的流行株为G血清型(VP7)，或者因为单价弱毒口服疫苗的免疫力低，对多宿主差异不能激发保护效果。

3．2 亚单位疫苗大多数PoRV亚单位疫苗的研发是表达PoRV的抗原相关蛋白的基因，制备抗原蛋白。RODRIGUEZ－DIAZ J等［25］采用重组PoRV表达系统表达牛轮状病毒RV株的VP2，PoRV流行株VP4、VP6和VP7表达产物自行组装成病毒颗粒样(VLPs)，用VP2、VP4、VP6和VP7或VP2、VP6和VP7。VLPs免疫7 w后均可产生特异的较高滴度血清抗体IgG，能抵御同型G3血清型的攻击，充分显示了VLPs良好的免疫原性和保护效果，体现PoRV VLPs作为亚单位疫苗具有良好的应用前景。

3．3 核酸疫苗核酸疫苗的研究在国内外都有大量文献报道，是将微囊化技术应用到DNA疫苗研究中，口服的免疫方式将微囊化VP6 DNA疫苗免疫小鼠，4 w后小鼠血清抗体滴度升高，6 w达到高峰，肠道SIgA明显升高，受到PoRV攻击后大便排毒量明显减少，未出现对小鼠显示出一定的保护性。微囊化DNA疫苗综合了DNA疫苗和微囊化疫苗的优点，为核酸疫苗的免疫途径开创了一条新的途径［26］。核酸疫苗具有亚单位疫苗的安全性和弱毒活疫苗的功效，但核酸疫苗也存在整合到宿主染色体、致突变、产生抗菌素DNA抗体等风险，其安全性有待于进一步研究。

3．4 以沙门氏菌为载体的口服DNA疫苗的新进展

减毒沙门氏菌本身可作为一种免疫佐剂，增强机体诱导黏膜免疫应答的能力。类脂A是沙门氏菌的LPS的主要成分之一，可刺激宿主细胞释放细胞因子，提高机体的免疫应答。以细菌为载体的DNA免疫可采用滴鼻、口服等途径进行免疫，方便于疫苗的大量群体接种，同时刺激机体产生黏膜免疫能有效防止病原在黏膜表面上定居以及入侵。最后，携带DNA疫苗的细菌侵入宿主后，在一段时间内有限增殖，具有持续刺激机体，诱导产生抗体的作用［27］。

4 问题与展望

疫苗研制的最佳构想应该包括:安全、有效果、多价、成本低及保存和使用方便等诸多因素，但要达到上述目标还需要一个漫长的探索过程。当前，传统疫苗存在一定的弊端;灭活疫苗和亚单位疫苗只能诱发体液免疫;减毒疫苗虽能诱发全面的免疫，但也存在返毒的风险;核酸疫苗虽然具有亚单位疫苗的安全性及减毒活疫苗的有效性，但核酸疫苗也存在使宿主致突变、产生抗菌素DNA抗体等危险。总之，猪病毒性腹泻疫苗的研究已经取得了一些可喜的成果，随着人们对病毒致病原认识的不断深入，猪病毒性腹泻的研发也在不断完善。

猪发生腹泻的致病机理和流行特点基本一致，仔猪发病率最高，且多存在混合感染［28］。因此，临床上建议给妊娠母猪免疫效果最好，使仔猪通过乳汁获得相应的母源抗体。此外，弱毒疫苗的研发一直都是薄弱环节，联苗的研发也是处于开发阶段，一些PEDV－TGEV－PoRV三联弱毒疫苗和PEDVTGEV二联灭活疫苗有着一针防多病、减少猪的应激和省时省力等重要意义，多联苗的研发有待进一步提高。

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Research Progress of Porcine Viral Diarrhea Vaccine

Yue Jun1，Hu Xingyi2，Tang Yu3，Ran Longzhong1，Li Tao1，Wang Hui1
(1．Animal Disease Prevention and Control Center in Guizhou Province，Guiyang Guizhou 550001，China;2．College of Animal Science，Guizhou University，Guiyang Guizhou 550025，China;3．Guizhou Province Station for Livestock Genetic Resources Management，Guiyang Guizhou 550001，China)

Porcine epidemic diarrhea virus(PEDV)，transmissible gastroenteritis virus(TGEV)and porcine rotavirus(PoRV)are the main pathogen of the swine virus diarrhea，Main clinical manifestations with vomiting，watery diarrhea，dehydration，gradually angular and other symptoms．Pigs of different ages and breeds can be infected，serious harm to the healthy development of the pig industry．Vaccination is one of the key measures for prevention and control of porcine viral diarrhea，however，a large number of clinical trials show that the antibody positive rate，the immunnity effect is not good．In this paper，the research progress of porcine viral diarrhea vaccine is reviewed，the aim is to provide reference for clinical prevention of porcine viral diarrhea．

Porcine Epidemic Diarrhea Virus(PEDV);Porcine Rotavirus(PoRV);Transmissible Gastroenteritis Virus(TGEV);Vaccine;Research Progress

S859．79+7

A

1007－1474(2016)06－0023－05

2016－09－08

贵州省科学技术厅农业攻关项目(黔科合NY［2015］3009－1号);“贵州省动物疫病防控与兽医公共卫生保障科技创新人才团队”(黔科合人才团队［2015］401号6)

岳筠(1981—)，女，兽医师，硕士，从事动物疫病综合防控工作。