董 菲 综述，孙成铭 审校

(1.青岛大学,山东青岛 266000；2.青岛大学医学院附属烟台毓璜顶医院检验中心,山东烟台264000)

·综 述·

节律基因在肿瘤中的研究进展*

董 菲1综述，孙成铭2△审校

(1.青岛大学,山东青岛 266000；2.青岛大学医学院附属烟台毓璜顶医院检验中心,山东烟台264000)

生物昼夜节律； 节律基因； 肿瘤； 细胞周期； 凋亡

生物昼夜节律是生物体内具有自我调节功能、以生命活动24 h为周期的一种生理节律系统，因其节律特性类似于钟表而被叫做生物钟。生物昼夜节律依照周期的长短分为亚日节律(ultradian rhythm)，周期短于1 d，如呼吸、心跳等；近日节律(circadian rhythm)，周期接近于24 h，如体温、血压、血细胞数量、激素分泌等；超日节律(infradian rhythm)，周期超过1 d，以月、年为周期，如迁徙、繁殖和冬眠等。近日节律是研究、应用最多的节律行为。生物昼夜节律调控着生物的生理、代谢和行为，与人类健康有着密切的关系，其异常可导致疾病或肿瘤的发生。近几年来随着科学技术的发展和人类认知水平的提高，兴起了研究生物昼夜节律的学科——时间生物学(Chronobiology)。时间生物学不断与多种学科交叉，为生命科学的探索注入了新鲜的血液。从20世纪70年代开始，随着分子生物学和蛋白质组学的发展，调控生物昼夜节律的基因相继被发现和研究应用，生物节律及其机制研究有了突破性的进展，其在肿瘤发生和进展中的作用也不断显现。现就生物昼夜节律基因的分子生物学机制及其在肿瘤中的研究进展作一综述。

1 节律基因调节生物节律的分子生物学机制

生物钟的功能是通过某些组织特异性基因的节律表达来一步步实现的，这些基因被称作节律基因或钟基因。迄今为止，在哺乳动物中发现的节律基因主要有Per1/2/3(Period1/2/3)、Tim(Timeless)、Clock、Npas2、Cry1/2(Crytochrome1/2)、Bmal1(brain and muscle ARNT-like-1)、孤儿核受体Rev-Erbα、Rorα(retinoic acid receptor-related orphan receptor α)、CKIε(Casein kinase 1ε)和Dec1/2(Differentiated embryo-chondrocyte expressed gene 1/2)等。生物节律的内源性机制主要由3个部分组成：(1)生物振荡器，由一组呈节律表达的基因及编码的蛋白质组成；(2)输入系统，接受信号传入到振荡器，调控相关基因的表达，光照、温度和食物都可以作为输入信号来调节和重置节律；(3)输出系统，由钟基因和一些钟控基因[1](如c-Myc，cyclin D，Wee1)及其蛋白产物组成，负责信号的输出。哺乳动物的主生物钟位于下丘脑的视交叉上核(suprachiasmatic nucleus,SCN)[2]，不同的物种对于生物节律的调节具有相似性，其基本模式都是由正调控元件和负调控元件组成的转录翻译反馈回路(transcription-translation feedback loops，TTFL)组成。

1.1 节律基因参与的反馈回路 真核生物的正向调控因子为Clock、Bmal1和Rora，能启动负调控基因的转录；负向调控因子为Per 1/2/3和Cry 1/2，当负调控蛋白达到一定的水平后，则通过负反馈回路抑制正向调控因子的转录激活；随后负调控蛋白被磷酸化和降解，正调控基因又重新启动转录。Bmal1是调节生物节律的重要转录因子，位于时钟体系的上游。BMAL1蛋白是正反馈回路的调节因子之一，分子伴侣是CLOCK 蛋白，两者都含有BHLH-PAS(basic helix-loop-helix,Period-Arnt-Single minded)结构域而具有与靶基因 DNA 转录激动结构E-box(enhancer box)5′-CAC GTG-3′结合进而促进其转录的能力。其具体分子水平调节机制如下所述。

1.1.1 核心通路 该反馈回路包括Per(Per1、2、3)和Cry(Cry1、2)。Bmal1基因作为时钟体系的起始因子，其产物BMAL1与CLOCK在bHLH 的介导下形成BMAL1/CLOCK异二聚体[3]。此二聚体通过结合Per和Cry基因启动子的E-box元件来激活基因转录，形成产物PER和CRY，在细胞质中组成PER/CRY复合物，随后PER/CRY复合物被转入神经核内，抑制BMAL1/CLOCK的活性，进而抑制自身基因的转录[4-5]。Npas2是Clock的同源基因，其蛋白产物与BMAL1形成异二聚体，促进Per和Cry基因的转录，从而维持生物节律[6]。

1.1.2 辅助通路 该反馈回路包括Rev-erb和Ror，产物为ROR (α、β、γ) 和REV-ERB (α、β) 蛋白，是核受体亚家族的成员。RORs作为转录激活因子，REV-ERBs作为转录抑制因子[7]，两者分别识别并结合位于靶基因上的ROREs调控元件。BMAL1/CLOCK与Ror及Rev-erb的E-box元件结合并激活其转录，随后RORs和REV-ERBs反过来结合位于Bmal1上ROREs的启动子来调节Bmal1的节律性表达[7]。

1.1.3 其他通路 节律系统也通过一些节律控制相关基因来影响其他生理过程。如核受体基因(the peroxisome proliferator-actived receptors α，PPARα)和PPAR γ[8]；细胞周期基因c-MYC、WEE1、 cyclinD和p21等。

1.2 节律基因的转录及翻译后调控 生物钟遵循着接近24 h的节律，这种节律的维持不仅与节律基因的转录有关，更与转录后对于mRNA和蛋白质水平的调节有关[9]。钟基因的转录后调控主要表现在：(1)mRNA的选择性剪接；(2)多聚腺苷酸化水平的调控，如SCN中加压素mRNA的转录水平是严格受到昼夜节律性调控的；(3)mRNA代谢转化调控[9]。生物钟基因的翻译后调控主要表现在：(1)细胞质中的磷酸化作用，如DBT使PER磷酸化，通过调节PER的稳定性和PER-TIM复合物进核时间影响果蝇生物钟基因表达的时相[10]；(2)细胞核中的磷酸化作用，许多生物钟元件的磷酸化过程主要发生在细胞核中[11]。另外，乙酰化[12]、泛素化[13]等表观遗传学修饰也在一定程度上参与了钟基因翻译后的调控。

2 生物昼夜节律与肿瘤的关系

生物节律的变化可使机体节律振幅延长或缩短，造成机体与环境失同步，导致节律失常性疾病。大量的流行病学研究发现昼夜节律紊乱使节律基因表达异常并增加了肿瘤的易感性，包括乳腺癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、结直肠癌和血液系统肿瘤等。世界卫生组织属下的“国际癌症研究机构”专家小组将常导致昼夜节律紊乱的夜班工作列为了致癌因素之一，由此可见，昼夜节律紊乱引起的节律基因异常对肿瘤的发生具有重要作用。

2.1 节律基因在肿瘤中的表达 Per基因作为分子钟反馈回路中的重要基因，在大部分的肿瘤中是低表达的，如肝细胞癌(HCC)[14]、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)[15]、乳腺癌[16]、胰腺癌[17]、结直肠癌(CRC)[18]和胶质瘤[19]等，因此Per基因常被认为是一种肿瘤抑制基因。Zhao等[20]对246例胃癌(GC)患者研究发现其Per1、Per2表达水平是下降的，并且Per2表达越低患者的生存期越短。与此相反，Hu等[21]的研究显示GC中Per2表达水平显著上调，并且Per3的表达水平与肿瘤患者的生存相关。研究发现，Cry1在GC[21]和CRC[22]晚期患者中的表达水平升高，并且与CRC患者预后呈正相关，过表达Cry1基因可促进CRC细胞增殖和迁徙。在其他肿瘤如肺癌、黑色素瘤和前列腺癌等恶性肿瘤中也发现了生物钟基因或其振荡节律的异常[23]。

节律基因除了在实体肿瘤中表达异常，在恶性血液肿瘤中也存在着表达变化。研究显示，Per2在急性髓细胞白血病(AML)患者中的表达明显降低，Per2的异常可能参与AML的起始和进展[24]。慢性粒细胞白血病(CML)慢性期和急变期Per1、Per2、 Per3、Cry1、 Cry2、 Cki和 Bmal1表达显著受损，而Clock和Tim基因的表达变化无时间依赖差异[25]。体外培养细胞发现Per2可通过阻断细胞周期和诱导凋亡来抑制K562细胞生长[26]。PER2还作为CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)的直接下游靶标在AML[27]和弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)[27]的发生和发展中发挥着作用。病例报告显示，非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者丧失了正常的睡眠节律，对其遗传和功能分析提示CRY2可能对NHL的发展有重要作用[28]。研究证明CRY可作为慢性淋巴细胞白血病(CLL)疾病进展早期预测指标，其中CRY1：PER2可作为CLL的独立预后指标[29]。

2.2 节律基因在肿瘤中的作用机制

2.2.1 节律基因参与细胞周期

2.2.1.1 c-Myc c-Myc作为癌基因参与G0/G1期转换，是细胞周期的关键性调节因子，它通过调控细胞周期蛋白E(Cyclin E)/细胞周期依赖性蛋白激酶2(Cdk2)复合物的活性参与细胞周期。c-Myc启动子含有E-box可被CLOCK/BMAL1结合，直接抑制c-Myc的转录[30]。

2.2.1.2 Cyclin D1/E Cyclin D1/E是G1/S期转换基因，决定细胞进入分裂期还是静止期。CyclinD1与Cdk形成复合物CyclinD1/Cdk4-6，使抑癌基因pRb蛋白磷酸化，细胞从G1期进入S期，促使细胞增殖。CyclinD1受生物钟调控，昼夜节律的紊乱可导致CyclinD1表达异常[31]。CyclinE是细胞周期的启动基因，可被CLOCK-BMAL1直接抑制，阻断CyclinE/Cdk2复合物的形成，从而阻止细胞G1/S期转换。

2.2.1.3 Wee1 Wee1为G2/M期转换基因。Wee1启动子含有E-box，受CLOCK/BMAL1复合物的正向调控。Bmal1表达达峰值时可激活Wee1，Wee1磷酸化失活CDK，激活CyclinB1，促使细胞从G2到M期转换。

2.2.1.4 p21 p21作为Cdks的抑制剂，能够被BMAL1调控的REV-ERBα蛋白抑制表达，从而激活Cdk1和Cdk2，促进细胞向S期和M期发展。

2.2.2 节律基因参与细胞凋亡 p53反应元件与E-Box有重叠，可阻止BMAL1/CLOCK与Per2的启动子结合[32]。过表达RORα可明显增加p53蛋白稳定性，从而增强p53功能，促进细胞凋亡[33]。敲除胶质瘤细胞的Clock基因可改变凋亡相关基因的表达，c-Myc和Cyclin B1蛋白表达降低，p53表达升高，导致细胞增殖降低、凋亡加速[34]。最近的研究表明，Cry还参与肿瘤坏死因子α(TNFα)的合成并激活凋亡通路[35]。这些结果提示钟基因与肿瘤细胞的凋亡过程密不可分。

3 小 结

如上所述，节律基因通过复杂的调控机制对肿瘤产生重要的影响。近年来，科研人员不断对节律基因进行多学科交叉研究，使生物节律在中、西医学和空间治疗学中(重力的变化可能会影响生物的节律[36])发挥作用，产生了新的相关学科如时间药理学、时间治疗学等。研究者可以利用节律基因在不同肿瘤及不同时间的表达水平变化，设计靶向药物，从而达到治疗肿瘤的目的。然而，利用钟基因对肿瘤实施靶向治疗既是机遇又是挑战，同时也存在制约性。靶向治疗忽略了药物靶标维护机体稳定性的基本生理功能，有可能使原来不平衡的体系更加恶化，从而给患者带来潜在的甚至致命的危险[37]。因此，最大限度地增加肿瘤的靶向效率和保护正常宿主细胞是成功应用靶向药物抵抗肿瘤的最大的挑战。生物节律本身还有无穷的奥妙有待人们去研究开发，因此需对生物节律展开更加深入的探索，人类必将更加重视并利用其研究成果。

[1]Claude G，Albert G.Entrainment of the Mammalian Cell Cycle by the Circadian Clock:Modeling Two Coupled Cellular Rhythms[J].PLoS Comput Biol,2012,8(5):e1002516.

[2]Mohawk JA,Takahashi JS.Cell autonomy and synchrony of suprachiasmatic nucleus circadian oscillators[J].Trends Neurosci,2011,34(7):349-358.

[3]Dibner C,Schibler U,Albrecht U.The mammalian circadian timing system:organization and coordination of central and peripheral clocks[J].Annu Rev Physiol，2010,72:517-519.

[4]Kelleher FC,Rao A,Maguire A.Circadian molecular clocks and cancer[J].Cancer Lett,2014,342(1):9-18.

[5]Yu EA,Weaver DR.Disrupting the circadian clock:gene-specific effects on aging,cancer,and other phenotypes[J].Aging (Albany NY)，2011,3(5):479-481.

[6]Reick M,Garcia JA,Dudley C,et al.NPAS2:an analog of clock operative in themammalian forebrain[J].Science,2001,293(5529):506-509.

[7]Cho H,Zhao X,Hatori M,et al.Regulation of circadian behaviour and metabolism by REV-ERBalpha and REV-ERB-beta[J].Nature,2012,485(7396):123-127.

[8]David P，Marciano,Mi Ra Chang,et al.The Therapeutic Potential of Nuclear Receptor Modulators for Treatment of Metabolic Disorders:PPARγ,RORs,and Rev-erbs[J].Cell Metab,2014,19(2):193-208.

[9]俞波,吴涛,倪银华，等.生物钟的转录后与翻译后水平的调控进展[J].生命科学,2011,28(4):470-476.

[10]Price JL,Fan JY,Keightley A,et al.Chapter Nine-The Role of Casein Kinase I in the Drosophila Circadian Clock[J].Methods Enzymol,2015,551(1):175-195.

[11]O′Neill JS,Maywood ES,Hastings MH.Cellular mechanisms of circadian pacemaking:beyond transcriptional loops[J].Handb Exp Pharmacol,2013,217(1)：67-103.

[12]Grimaldi B,Nakahata Y,Kaluzova M,et al.Chromatin remodeling,metabolism and circadian clocks:the interplay of CLOCK and SIRT1[J].Int J Biochem Cell Biol，2009，41(1):81-86.

[13]Stojkovic K,Wing SS,Cermakian N.A central role for ubiquitination within a circadian clock protein modification code[J].Front Mol Neurosci,2014,7(1):69.

[14]Yang SL,Yu C,Jiang JX,et al.Hepatitis B virus X protein disrupts the balance of the expression of circadian rhythm genes in hepatocellular carcinoma[J].Oncol Lett,2014,8(6):2715-2720.

[15]Hsu CM,Lin SF,Lu CT,et al.Altered expression of circadian clock genes in head and neck squamous cell carcinoma[J].Tumor Biol,2012,33(1):149-155.

[16]Cadenas C,van de Sandt L,Edlund K,et al.Loss of circadian clock gene expression is associated with tumor progression in breast cancer[J].Cell Cycle,2014,13(20):3282-3291.

[17]Relles D,Sendecki J,Chipitsyna G,et al.Circadian gene expression and clinicopathologic correlates in pancreatic cancer[J].J Gastrointest Surg,2013,17(3):443-450.

[18]Karantanos T,Theodoropoulos G,Pektasides D,et al.Clock genes:their role in colorectal cancer[J].World J Gastroenterol,2014,20(8):1986-1992.

[19]Wang F,Luo Y,Li C,Chen L.Correlation between deregulated expression of PER2 gene and degree of glioma malignancy[J].Tumori，2014，100(6):e266-272.

[20]Zhao H,Zeng ZL,Yang J.Prognostic relevance of Period1 (Per1) and Period2(Per2) expression in human gastric cancer[J].Int J Clin Exp Pathol,2014,7(2):619-630.

[21]Hu ML,Yeh KT,Lin PM,et al.Deregulated expression of circadian clock genes in gastric cancer[J].BMC Gastroenterol,2014,14(1):67-69.

[22]Yu H,Meng X,Wu J,et al.Cryptochrome 1 overexpression correlates with tumor progression and poor prognosis in patients with colorectal cancer[J].PLoS One,2013,8(4):e61679.

[23]Rana S,Mahmood S.Circadian rhythm and its role in malignancy[J].J Circadian Rhythms,2010,8(1):3-5.

[24]Gery S,Koeffler HP.Per2 is a C/EBP target gene implicated in myeloid leukemia[J].Integr Cancer Ther,2009,8(4):317-320.

[25]Yang MY,Yang WC,Lin PM,et al.Altered expression of circadian clock genes in human chronic myeloid leukemia[J].J Biol Rhythms,2011,26(2):136-148.

[26]Sun CM,Huang SF,Zeng JM,et al.Per2 Inhibits K562 Leukemia Cell Growth In Vitro and In Vivo Through Cell Cycle Arrest and Apoptosis Induction[J].Pathol Oncol Res,2010,16(3):403-411.

[27]Thoennissen NH,Thoennissen GB,Abbassi S,et al.Transcription factor CCAAT/enhancer-binding protein alpha and critical circadian clock downstream target genePER2 are highly deregulated in diffuse large B-cell lymphoma[J].Leuk Lymphoma,2012,53(8):1577-1585.

[28]Hoffman AE,Zheng T,Stevens RG,et al.Clock-Cancer Connection in Non-Hodgkin′s Lymphoma:A Genetic Association Study and Pathway Analysis of the Circadian Gene Cryptochrome 2[J].Cancer Res,2009,69(8):3605-3613.

[29]Eisele L,Prinz R,Klein-Hitpass L,et al.Combined PER2 and CRY1 expression predicts outcome in chronic lymphocytic leukemia[J].Eur J Haematol 2009,83(4):320-327.

[30]Soták M1,Sumová A,Pácha J.Cross-talk between the circadian clock and the cell cycle in cancer[J].Annals of Medicine,2014，46(2):221-232.

[31]Zeng ZL,Wu MW,Sun J,et al.Effects of the biological clock gene Bmal1 on tumour growth and anti-cancer drug activity[J].J Biochem,2010,148(3):319-326.

[32]Takao Miki,Tomoko Matsumoto,Zhaoyang Zhao,et al.p53 Regulates Period2 Expression and the Circadian Clock[J].Nat Commun,2013,2(4):2444.doi:10.1038/ncomms3444.

[33]Wang Y,Solt LA,Kojetin DJ,et al.Regulation of p53 Stability and Apoptosis by a ROR Agonist[J].PLoS One,2012,7(4):e34921.

[34]Wang F,Li C,Yongluo,et al.The Circadian Gene Clock Plays an Important Role in Cell Apoptosis and the DNA Damage Response In Vitro[J].Technol Cancer Res Treat，2015，12(1):15-18.pii:1533034615585433.

[35]Hashiramoto A,Yamane T,Tsumiyama K,et al.Mammalian Clock Gene Cryptochrome Regulates Arthritis via Proinflammatory Cytokine TNF-{alpha}[J].J Immunol，2010，184(3):1560-1565.

[36]Wang DN,Zhang L,Wan YF,et al.Space meets time:Impact of gravity on circadian timing systems[J].Supplement of Science,2014，30(2):215-217.

[37]Lodish MB.Clinical review:kinase inhibitors:adverse effects related to the endocrine system[J].J Clin Endocrinol Metab,2013,98(4):1333-1342.

山东省英才基金项目(2015ZRA06016)。

董菲，女，硕士，主要从事白血病的发病机制研究。

△，E-mail：18953569897@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.07.028 文献标识码：A 文章编号：1673-4130(2016)07-0941-04

2015-11-28)