廖文英　康洁　陈育芬　刘朝富



非编码RNA与肝细胞癌的研究进展

廖文英康洁陈育芬刘朝富

521000广东潮州解放军第一八八医院肿瘤科

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是临床上的常见恶性肿瘤之一，也是第三大导致癌症病死的原因[1]。由于缺少有效的治疗措施，晚期HCC常常导致患者快速死亡。与其它多种恶性肿瘤相似，HCC的发生中存在着多种基因网络及信号通路的调控异常。这些改变的基因包括可编码蛋白质的基因及非编码RNA(noncoding RNA，ncRNA)。近年来，随着对微小RNA(micro-RNA，miRNA)研究的深入，逐渐认识到包括miRNA在内的ncRNA在HCC的发生、发展及转移中扮演着十分重要的角色。ncRNA是一种不翻译为蛋白质的功能性RNA，人类的基因组中只有不足2%的基因序列最终翻译为功能性蛋白质，其他很大比例是转录为ncRNA，并通过多种途径直接发挥生物学作用[2]。ncRNA具有多种类型，且不同类型的转录谱是存在着巨大差异的。同时，人基因组编码的ncRNA数量仍属未知，也不断有研究发现全新的功能性ncRNA[3]。长链非编码RNA (long noncoding RNA，lncRNA)是大小超过200个核苷酸长度的ncRNA。虽然与microRNA相比其生物学功能尚不明确，但是越来越多的研究显示lncRNA可通过多种机制来干预相关基因的表达。在HCC中，ncRNA作为致病、诊断、预后及治疗相关的研究靶点也逐渐引起学者的关注。在此，我们对ncRNA与HCC的关系进行简要的综述。

一、HCC的发生与ncRNA

miRNA是由约22个核苷酸组成的小分子ncRNA，主要通过抑制靶标miRNA转录或诱导3′未翻译区(UTRs)的转录互补序列降解来调节基因表达[4]。目前，随着测序技术的不断进展，已发现人类基因组中约有2 000个miRNA，并参与调节约30 000个基因的表达及蛋白合成[5]。其中许多miRNA已被证明在正常细胞功能中发挥了关键的调控作用[6]。人类癌细胞基因组中常常存在miRNA的表达改变，而且与癌症的发生及进展密切相关。miRNA与多种促进恶性肿瘤的生物学过程相关，如：凋亡、增殖、血管新生、对信号通路的控制等。大量的研究数据显示，HCC的发生类似其他恶性肿瘤，经由miRNA影响抑癌及促癌基因的表达来促进HCC的发生[7]。HCC中最显著的异常表达miRNA包括起上调作用的miR-221、miR-21、miR-18等，以及起下调作用的miR-122a、miR-199a、miR-200等[8, 9]。这些miRNA调控的靶标基因与HCC的发生有潜在关系。

慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)及丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染是导致绝大多数HCC发生的原因。HBV DNA可整合至宿主基因组从而对细胞转录进行控制，增加肝细胞致癌的敏感性。miRNA可通过调节HBV本身的基因表达转录从而调节HBV感染，进而影响HCC的发生[10]。miR-18a的靶标是雌激素受体α(ER-α)。Liu等[11]的研究显示，在女性HBV感染者中miR-18a存在过量表达，支持了mir-18a通过ER-α调节的HBV转录表达。同时，Zhang等[12]也发现，通过上调miR-152、miR-148或miR-1表达从而调节HDAC4来实现对DNA甲基转移酶活性的抑制可减弱HBV复制，从而降低HCC风险。此外，miR-196可直接抑制HCV转录，从而减少HCC发生的风险。HCC也可发生于非病毒性因素所致肝硬化，如酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)。酒精的摄入与miR-199、miR-200、miR-126等的表达降低相关，这些miRNA的异常表达也可在HCC中观察到。HCC的另一个危险因素是NASH，已经确证的是NASH可增高发生肝纤维化及HCC的风险。Elton等[13]的研究也发现，在NASH相关的饮食模型的患者中，存在着miR-155表达上调。miR-155可以靶向作用于抑癌基因C/EBP β，同时还可下调HBV病毒的转录。

lncRNA的长度变化范围较大，平均约为592个核苷酸，较mRNA更短(平均2453个核苷酸)[14]。大多数lncRNA存在于细胞核内，参与基因表达的后期调节，可使用如基因芯片或转录组分析等生物信息学技术检出。近年来，逐渐发现lncRNAs在基因表达及信号通路调节中有重要作用。与蛋白编码基因相似，lncRNA是由染色质标记、独立基因启动子、转录调控因子及多个外显子拼接而成的成熟转录模板[15]。使用全基因组测序及二代测序技术在鼠体内转录组中发现了数以万计的lncRNA转录，这些结果正逐步应用于人ncRNA的研究。与其他RNA相似，lncRNA具有作为疾病或临床应答的生物学标记的潜在作用。最新的研究显示，lncRNA是多种恶性肿瘤的重要调节因子，如MALAT1(与转移性肺腺癌相关)、HOTAIR(HOX反转录基因RNA)、H19、 HULC(在HCC中显著上调)、PRNCR1(前列腺癌非编码RNA1)等lncRNA在包括HCC在内的多种肿瘤中存在异常表达[16]。如Lai等[17]的研究显示，MALAT1在HCC中明显上调且中可促进小鼠模型上HCC发生，提示其具有促进肿瘤细胞侵袭及转移的能力。在HepG2细胞系中MALAT1的抑制可明显减少癌细胞的生存力、活力及侵袭能力，并且增强癌细胞凋亡。另一种lncRNA——HOTAIR在HCC组织中的表达存在显著上调，而且这种升高与HCC患者不良预后也存在相关性[18]。此外，HOTAIR还可下调RNA结合蛋白-38，促进HCC中癌细胞的迁徙。H19基因编码位于11p15.5上的一段2.3 kb lncRNA，其在母系等位基因上专项表达，并且与生长发育相关的基因突变相关[19]。HULC基因是位于染色体6p24.3上一段长556 bp的核苷酸序列，是最先被描述的在HCC中显著上调的特异性lncRNA。Du等[20]的重要研究显示，HBV的HBx蛋白可以通过抑制p18活性来增高HULC表达，从而促进肝癌细胞的增殖与侵袭，在HCC的发生与发展中发挥重要作用。尽管lncRNA对多种重要功能基因的调节效应较为确定及普遍，但是lncRNA在HCC和其他癌症发生机制中所起的生物学作用尚待深入阐述。

二、ncRNA用于HCC的诊断及预后

大量的研究提示，miRNA作为疾病诊断或预后的生物标志物有着十分重要的临床意义。包括miRNA、lncRNA在内的多种ncRNA已被证实在HCC或其他类型恶性肿瘤的外周循环或体液中存在着异常表达[21]。外周循环中的大部分miRNA存在于封闭的细胞外囊泡中，这种运输方式与高密度脂蛋白及Argonaute 2蛋白等相关[22]。miRNA可被血液循环运输到不同部位，从而对不同靶组织发挥十分复杂多样的生物学作用。Kogure等[23]的研究显示，细胞外囊泡内的miRNA可经由HCC组织的细胞间质因子作用而被癌细胞摄取，并发挥相应的调节功能。而部分非囊泡运输的循环 miRNA的功能效应还未得到阐述，这类特殊的miRNA在HCC中发挥何种功能也仍属未知。RNA分子通常不被被动机制摄取，而更倾向于通过内源性核酸酶发生退化。因此，检测在HCC中释放的循环miRNA情况，可为疾病的诊断及预后提供重要参考。

慢性HBV及HCV感染是引起HCC的主要原因，筛查这些感染患者的HCC特异性生物标记也具有重要临床价值。HCV相关性HCC中可出现特异性的miR-100、miR-122、miR-221及miR-224表达显著上调，也已有针对这类miRNA作为诊断标志物的研究进行[24]。循环miR-101也是HBV相关性HCC潜在的生物学标志物，与HCC病理分级及预后显著相关[25]。此外，检测HCC组织及循环中特定miRNA的表达也有助于HCC的预后判断。HCC组织中多种miRNA存在异常表达，如：miR-199a、miR-199b-3p、miR-26及miR-29，且与患者远期生存有关[26]。此外，Zhang等[27]的研究还发现，HCC中miR-148b的表达降低也与生存预后差有关。Karakatsanis等[28]的研究显示，miR-21、miR-31、miR-122、miR-221及miR-222在 HCC组织中显著上调，而且，miR-21、miR-31、miR-122、miR-221的表达上调与肝硬化发生相关，miR-21及miR-221与肿瘤分期及预后相关。但是这些研究大多数都只停留在对临床现象及相关性的分析，仍缺少对miRNA与HCC发生发展机制的更深入研究探讨。

特定类型的恶性肿瘤可存在lncRNA的特异性表达，这也与miRNA相似，提示其也具有诊断、预后或作为治疗靶点的潜在价值。如Ishibashi等[18]的研究显示，高表达HOTAIR(一种lncRNA)的HCC患者较低表达或不表达HOTAIR患者预后更差，同时HOTAIR可预测HCC患者治疗后的复发情况，体外细胞试验也显示HOTAIR表达上调可使癌细胞增殖更快。此外，HCC风险与多种miRNA的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)相关，如miR-let-7与rs10877887、miR-101-1与rs7536540及miR-34b与rs4938723等[29, 30]。与HCC相关的lncRNA的SNP研究数据较少得到报道，但是与癌症相关定位于非编码区的SNP可通过lncRNA的转录异常表现出来[31]。然而多种ncRNA相关的SNP研究的结果并不一致，可能与研究的种族背景不同有关，ncRNA的差异性表达及功能改变是否与特定位点的SNP相关仍需更深入的研究。

三、靶向ncRNA的HCC治疗

虽然外科手术或肝移植是HCC治疗的最主要方法，但是大多数HCC患者诊断明确时即为晚期，无法进行手术或移植，预后极差。针对这类患者的全身或局部治疗可有效延缓HCC进展。靶向HCC中的异常表达lncRNA，可能更好地用于区分对药物治疗敏感的患者，为临床提供全新的治疗方式。miRNA可能抑制多个基因的表达，从而调控与HCC生长相关的多个信号通路[32]。HCC中显著表达的miRNA是miR-21，其过量表达与肿瘤进展及不良预后有关[33]。另一些其他miRNA，如：miR-151及miR-221/222在HCC患者中表达显著增加，也可以作为介入治疗的潜在靶点[34]。同样，通过调节HCC中干扰抑癌基因的miRNA的方法，也是阻止HCC恶化的有效方法。Chen等[35]的研究发现，使用特异性抗体来沉默miR-221表达，可阻止原位癌动物模型肿瘤的进展，增加总体存活率。因此，沉默miR-221可减少HCC中癌细胞的扩散，增强细胞凋亡，导致恶性细胞复制周期终止。

病毒感染的前提与HCC的发生有特定关系，治疗调整与肝炎病毒和HCC相关的ncRNA的表达，可能潜在减缓疾病进展及HCC的发生。Diaz等[24]的研究发现HCV相关HCC中特异性表达18种 miRNA，与其它肝病相比具有高度特异性，未来靶向这些miRNA可能有助于预防甚至治疗HCV相关HCC。miR-122是肝细胞特异性miRNA，通过与HCV基因5′-UTR上两个关联位点的相互作用，调节HCV RNA的稳定性，从而刺激HCV复制。因此，miR-122在慢性HCV感染中的靶向治疗极具吸引力。I、 II期临床试验使用miR-122寡核苷酸抗体靶向结合miR-122，显示了对HCV复制的强效抑制性及安全性[36]。一个交替的办法是使用小分子来调节HCV中的miR-122。目前有多种方法可用于miRNA表达的调控，包括抑制miRNA及替换miRNA，从而调节下游相关基因的表达。miRNA替换在miRNA折叠时完成，而通过siRNAs可靶向抑制miRNA表达。此外，通过导入具有多靶向miRNA结合位点的载体，可以作为底物竞争性抑制靶向miRNA表达[37]。lncRNA也表现出作为治疗靶点的潜在价值。H19作为一类具有致癌lncRNA，在HCC中存在高表达。靶向H19治疗已在在患有胰腺、膀胱、卵巢肿瘤患者中进行评估，用于HCC的研究也获得了批准。调节干预HCC相关lncRNA表达的方法与前面描述的miRNA的方法类似。相较其他类型的肿瘤，以miRNA或lncRNA为靶点的相关疗法在HCC中的应用研究更为广泛及重要。但是基于这些方法的药物仍在研究中，从基础研究到临床应用的过程仍相对漫长。

四、问题及展望

总的来说，目前大量的研究获得了与HCC相关的ncRNA的数据信息，且以miRNA为主，其他如lncRNA相关的研究也在不断拓展中。这类ncRNA的共同特征是在HCC中异常表达，并具有作为HCC诊断、预后及治疗生物学标志物的潜在价值。对ncRNAs参与的HCC相关分子机制的深入研究，有助于确定更佳的治疗靶点来控制肿瘤的形成及进展。同时，也需要更完善的研究来改进靶向ncRNA的HCC治疗方法。

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(本文编辑：张苗)

通信作者：刘朝富，Email：liuchaofu2007@sina.com

(收稿日期：2015-12-23)