徐 磊，贾玉堂*，赵拴平，贾玉立

(1.安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，安徽 合肥 230031；2.安徽省颍上牛哥牧业科技有限公司，安徽 颍上 236222)

蛋氨酸铜对隐性发情大别山牛外周血生殖激素分泌的影响

徐 磊1，贾玉堂1*，赵拴平1，贾玉立2

(1.安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，安徽 合肥 230031；2.安徽省颍上牛哥牧业科技有限公司，安徽 颍上 236222)

[目的]日粮中添加蛋氨酸铜旨在为防治隐性发情提供理论依据。[方法]选用12头膘情中等、生殖机能正常、隐性发情的空怀青年大别山牛母牛，随机分为3组，研究补饲铜(蛋氨酸铜为铜源，日粮分别添加0、10和20 mg Cu/kg DM)对隐性发情大别山牛发情周期中外周血生殖激素(E2、P 、T、LH、FSH)分泌规律的影响和对隐性发情的防制效果。[结果]表明，添加铜20 mg Cu/kg DM组提高了发情周期E2的平均浓度(P<0.01)、降低P(P<0.01)的平均浓度，同时20 mg组显著改善了大别山黄牛的隐性发情，发情外部表现评分从4提高到8.125，正常发情率达到75%。[结论]说明添加蛋氨酸铜源铜水平20 mg/kg DM能够影响隐性发情大别山黄牛的生殖激素分泌，能有效的防治大别山牛的隐性发情。

大别山牛；蛋氨酸铜；生殖激素水平；隐性发情

随着规模化母牛养殖逐渐增多，母牛的繁殖效率问题日益凸显，在舍饲化养殖中异常发情对母牛养殖的效益影响占很大比重，其中隐性发情是舍饲化条件下母牛异常发情的主要表现。隐性发情是指母牛发情时缺乏性欲表现，但其卵巢内有卵泡发育成熟而排卵，这种牛或发情时间短、或不表现发情症状，不易察觉，很易漏情失配，影响能繁母牛的利用率和繁育牛场的养殖效益。产生这种现象的主要原因是体内生殖激素分泌失调，雌激素分泌不足，中枢对雌激素的敏感性降低[1]。母牛的隐性发情与生殖激素雌二醇、睾酮等的分泌异常有关，通过对正常发情和隐性发情大别山牛母牛发情周期内血清中生殖激素水平进行检测发现，隐性发情组母牛发情周期内血清E2浓度低于正常发情组，T浓度显著高于正常发情组，而且正常发情组与隐性发情组母牛血清中FSH和LH浓度升高下降的趋势是相反的。

铜作为一种重要的微量元素，对牛的繁殖机能有重要作用，母牛缺铜易出现卵巢机能低下，发情紊乱、受胎率低，发生不孕、流产、死胎、分娩困难，胎衣不下等情况[2]。当补充充足的铜后，可以提高母牛的繁殖力，降低返情率[3]。刘强等对硫酸铜和几种有机铜源的研究表明，日粮添加富铜酵母、赖氨酸铜、蛋氨酸铜等铜源能提高西门塔尔牛发情周期生殖激素的分泌水平[4-5]。据此，本项试验通过在隐性发情大别山牛日粮中添加不同水平的蛋氨酸铜，测定发情周期血液中生殖激素(雌二醇 (E2)、孕酮(P)、睾酮(T)、促黄体素(LH)、促卵泡素(FSH))的含量，了解其正常变化规律及赖氨酸铜对生殖激素分泌规律和隐性发情的影响，为研究隐性发情大别山牛的生殖生理和利用营养措施进行隐性发情防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验牛选择及试验设计

选取颍上牛哥牧业科技有限公司大别山牛母牛为试验牛，并随机选择膘情中等、体况相似、生殖机能正常，有隐性发情表现的空怀青年大别山牛母牛20头。为使试验牛群情期一致，试验开始前先进行同期发情处理，先肌肉注射PG 100 μg/头 GnRH，第8 d肌肉注射0.4 mg PG，第10 d肌肉注射100 μg/头GnRH。为减少激素干扰，同期发情处理后间隔两个情期开始试验。经同情发情处理后，最终选择15头试验隐性发情母牛，分3组：组1为对照组，饲喂基础日粮；组2和组3分别在基础日粮中添加铜10 mg/kg DM和20 mg/kg DM，采用广州科天公司生产的蛋氨酸螯合铜(含铜21%)作为铜源。

1.2 试验日粮及饲养管理

基础精的组成和营养成分见表1。试验牛均沿用牛场原来的饲养方法，使用散栏饲养，全天饲喂二次(6点和18点)，自动饮水器自由饮水。

表1 试验牛精料组成和营养成分

1.3 母牛发情判定方法

试验期间，每天在6∶00、14∶00和20∶00观察三次母牛发情表现，每次不少于半小时。正常发情牛发情表现明显：阴户肿胀明显，有清亮黏液流出，兴奋鸣叫，有明显的发情征状，始时爬跨其他牛只，最终接受其他牛只爬跨。隐性发情表现较弱：阴户稍或无肿胀，爬跨其他牛只，但不接受其他牛只爬跨，仅在卧下时阴户有少量黏液流出。对有以上表现牛进行直肠检查，触摸卵泡发育及排卵情况，以有成熟卵泡视为发情，依此区分正常发情组牛和隐性发情组牛。根据母牛发情表现及权重，同时为数量化试验母牛发情症状，初步制定了一个母牛隐性发情评分标准，得分6分以下为隐性发情，超过6分可认为正常发情表现。评分标准如表2。

表2 母牛发情表现评分标准

1.4 采样方法

同期发情处理间隔两个情期后开始采样，第三次发情当天开始每天采样，直至下次发情，为接近空腹采血效果，采样时间均为14:0015:00。所采血样室温静置1 h后4 000r/min离心10 min，分离血清置-20℃保存备用。

1.5 试验样品血清中生殖激素和铜含量的测定

样品血清中生殖激素：E2、P 、T、LH、FSH送至合肥市滨湖医院检验科采用西门子immulite2000全自动化学发光免疫分析仪测定。血清铜浓度采用北京雷根生物技术有限公司生产的Cu prizone比色法铜检测试剂盒检测。

1.6 试验数据统计分析

应用卡方分析，试验结果均表示为平均值±标准差，数据基本处理使用Excel与SAS 9.0进行。

2 结果与分析

2.1 蛋氨酸铜对隐性发情大别山牛母牛发情表现的影响

根据母牛发情表现评分标准，三组试验牛发情表现评分结果如表3所示：对照组牛的发情表现均只有掉白，而无其他表现，全部表现为隐性发情，评价均为4分；添加10 mg/kg DM组试验牛有2头只表现掉白，另两头分别得分7和5.5，从结果来看有一头表现为正常发情；添加20 mg/kg DM组试验牛只有一头表现为隐性发情，得分为4，另三头均表现为正常发情，分别得分10、10、8.5。日粮中添加蛋氨酸铜显著提高了隐性发情大别山母牛的发情评分，添加量为20 mg/kg DM组试验牛发情评分最高。

表3 3组试验牛发情表现评分

2.2 蛋氨酸铜对隐性发情大别山牛母牛发情周期雌二醇(E2)分泌的影响

由表4和图1可知，3组试验中，对照组、10 mg组和20 mg组全发情周期内E2平均浓度分别为：16.43 pg/ml、16.49 pg/ml、20.43 pg/ml，组二和组三在发情周期内E2血清浓度逐天平均值不显著和极显著高于对照组(P>0.05、P<0.01)。E2浓度从发情期最高，随后开始下降趋势，第13天后开始波动上升。两个蛋氨酸铜添加组E2浓度在发情时达到最高峰，分别为28.33 pg/ml和38.5 pg/ml。

表4 发情周期血清雌二醇浓度 pg/ml

注：同行肩注小写不同字母表示差异显著(P<0.05)，大写不同字母表示差异极显著(P<0.01)，下表均同。

图1 发情周期血清中雌二醇浓度的变化曲线

2.3 蛋氨酸铜对隐性发情大别山牛母牛发情周期睾酮(T)分泌的影响

由表5和图2可知，对照组、10 mg组和20 mg组全发情周期内T平均浓度分别为：9.18 pg/ml、6.98 pg/ml、4.63 pg/ml。组2和组3在发情周期内T血清浓度逐天平均值低于对照组，但差异不显著，对照组在第4 d和第14 d有高峰，其他时间浓度较低，组2只在第7到8天有高峰，组3全期较平稳且水平较低。

表5 发情周期血清睾酮浓度 (ng/dl)

图2 发情周期血清中t浓度的变化曲线

2.4 蛋氨酸铜对隐性发情大别山牛母牛发情周期孕酮(P)分泌的影响

由表6和图3可知，对照组、10 mg组和20 mg组全发情周期内P平均浓度分别为：5.00 ng/dl、3.54 ng/dl和3.41 ng/dl。组2和组3在发情周期内P血清浓度逐天平均著低于对照组，且差异极显著(P<0.01)，3组的P浓度都是从发情当天最低，并开始逐渐上升，到第15、16 d开始下降，而组3到第20 d下降到发情时的最低水平，组2第20 d浓度还较高，对照组在第19 d反而是上升到全期的最高值。

表6 发情周期血清孕酮浓度 ng/dl

图3 发情周期血清中P浓度的变化曲线

2.5 蛋氨酸铜对隐性发情大别山牛母牛发情周期促黄体素(LH)分泌的影响

由表7和图4可知，对照组、10 mg组和20 mg组全发情周期内LH平均浓度分别为：0.47 mIU/ml、0.21 mIU/ml、0.04 mIU/ml，差异并不显著。对照组在第7 d有一个高峰值，达8.36 mIU/ml，组2只在第5和第9 d有较高的峰值为2.36 mIU/mL和5.4 mIU/mL，组三全期水平均较低(0.23 mIU/mL)。

表7 发情周期血清促黄体素浓度 mIU/ml

图4 发情周期血清中LH浓度的变化曲线

2.6 蛋氨酸铜对隐性发情大别山牛母牛发情周期促卵泡素(FSH)分泌的影响

由表8和图5可知，对照组、10 mg组和20 mg组全发情周期内FSH平均浓度分别为：90.4 Miu/dl、54.17 Miu/dl、73.78 Miu/dl，三组发情周期内FSH血清浓度逐天平均值差异不显著(P>0.05)，三组试验牛在发情时FSH浓度相对全周期处于较高水平，且组三发情时的浓度为全期最高，而对照组在第5和第9天有最高的峰值分别为369.5 Miu/dl和345 Miu/dl，10 mg组只有第4天有较高峰336.67 Miu/dl。

表8 发情周期血清促卵泡素浓度 Miu/dl

图5 发情周期血清中FSH浓度的变化曲线

3 讨论

3.1 添加蛋氨酸铜对隐性发情大别山牛母牛发情周期生殖激素的影响

母牛的发情周期中，少量的P4能与雌激素共同作用使母畜出现外部发情表现，而大量P4会抑制垂体FSH和LH的释放，从而抑制发情14[6]。Smith对12头奶牛的测定结果表明，发情前4 d P4开始下降直到发情为1 ng/mL，在周期中达到了6～7 ng/mL[7]。Beckers测定了15头法国荷斯坦牛的P4水平，结果从发情前5 d的6.0 ng/mL降低到发情时的0.6 ng/mL，之后增加到第15天的7.19 ng/mL[8]。在本研究中，添加20 mg/kg DM铜组发情周期P的分泌平均为3.41 pg/ml，发情时最低，逐渐升高，在第14 d～17 d较高，发情前2 d处于下降过程，10 mg/kg DM铜组与20 mg组P分泌类似。这与卵泡的发育及形态变化相一致[10]，这种P水平在发情前的的迅速下降，是引起发情行为所必须的[11]。但在对照组中，第14到17天的下降趋势并不明显。

E2的分泌与P相反，添加20 mg/kg DM铜组E2分泌在发情时达到高峰，随后开始下降，在第7 d开始上升，第10 d达到峰值，短暂的下降后，在第12 d到发情前是波动上升的。10 mg组和对照组也是同样的趋势，但发情时的分泌水平显著低于20 mg组。Melampy给切除卵巢的奶牛注射低剂量的P4，12 h后再注射雌激素，结果引起奶牛明显的发情现象[11]，表明P4与E2在引起发情时是协同作用的。Smith认为周期中E2有两个峰，第一个峰出现在发情前1 d，峰值为11.2 pg/ml，第二个峰出现在6～8 d，峰值为7.9 pg/ml[12]，这些结论与本试验结果相接近。王聪等的研究表明日粮中添加铜对发情周期孕酮和雌二醇分泌有促进作用[19]，在本研究中，添加蛋氨酸铜显著提高了大别山牛发情周期中的雌二醇的浓度，但孕酮浓度有所下降可能由于品种间的差异，而且雌二醇对肉牛的发情有促进作用，孕酮作为孕激素的功能主要表现在少量的孕酮与雌激素协同促进母牛发情和维持妊娠、促进乳腺腺泡发育等。

FSH与LH协同促进卵泡生长成熟和粒膜增生，能够促进排卵和形成黄体，并参与内膜细胞合成分泌雌激素。Madej测定了5头荷斯坦奶牛发情周期的LH分泌，基础值较低，只在排卵前几小时出现一个单独的峰[13]。Larsson用超声波结合测定LH，研究LH与排卵的关系，认为LH峰只出现在发情开始后的7.4 h[14]。本研究采取每天采样一次，没有检测到这个发情后7.5 h的峰，但添加20 mg/kg DM铜组的LH分泌全期平均在0.03 mIU/ml，水平较低，与以上研究一致。但对照组在第7 d时出现了一个较高的峰值8.36 mIU/ml，这个异常也可能与其隐性发情有关。FSH能够刺激卵巢生长和促进出现空腔的卵泡继续发育增大并接近成熟，本研究中三组试验牛在第4 d和第9 d左右出现的峰值与此一致。添加20 mg/kg DM铜组的两个峰值较另两组低，且全期FSH分泌水平也显著低于另两组。

T属于雄性激素，对母牛来说睾酮主要是由肾上腺分泌，正常情况下浓度应该偏低。本研究中，除20 mg/kg组中全期水平较低，对照组和10 mg/kg组中分别有较高的峰值，分别达到60.3 pg/ml和32.5 pg/ml，这说明大别山牛表现隐性发情可能与他们的睾酮异常升高有关。

3.2 添加蛋氨酸铜对大别山牛隐性发情的防制效果

母牛发育到一定年龄，便开始出现发情，发情是未孕母牛所表现的一种周期性变化，发情时，卵巢上有卵泡迅速发育，它所产生的雌激素作用于生殖道使之表现出一系列变化，为受精提供条件；雌激素还能使母牛产生性欲和性兴奋，以及允许雄性爬跨、交配等外部行为的变化。但母牛隐性发情的原因沿未见明确的报道，普遍认为引起隐性发情的原因有长期舍饲、运动不足、光照少、饲料单一、营养不良、缺乏矿物质饲料或维生素A、D及微量元素等原因，引起雌激素分泌不足，体内激素平衡失调而造成[16]。本研究中，日粮中添加蛋氨酸铜对大别山牛隐性发情母牛有明显的防治作用，其中添加20 mg/kg DM铜组隐性发情改善效果最明显，这可能是因为大别山牛隐性发情是由于其铜的摄入不足导致激素分泌紊乱而引起，所以添加铜对隐性发情牛发情表现有明显防治作用。

4 结论

本研究结果表明，日糖中添加蛋氨酸铜20 mg/kg DM，可以极显著提高大别山牛母牛发情周期中E2的平均浓度、极显著降低P的平均浓度，能显著改善大别山黄牛的隐性发情，发情外部表现评分从4提高到8.125。

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Effects of Copper Methionine on the Secretion of Peripheral Blood Reproductive Hormone Level on Recessive Estrus Dabieshan Heifers

XU Lei, JIA Yu-tang1*, ZHAO Shuan-quan1, JIA Yu-li2

(1.AnhuiAcademyofAgriculturalSciencesInstituteofAnimalHusbandryandVeterinary,Hefei230031,Anhui;2.AnhuiYingshangNiugeAnimalHusbandryandTechnologylimitedCompanyYingshang236222,Anhui)

[Objective] The aim of this study was to provide theoretical basis for the prevention and treatment of cattle recessive estrus. [Method] Twelve young recessive estrus non pregnant Dabieshan heifers, with medium body size, well reproductive condition, were chosen and randomly divided into three groups. These groups were used to study the effect of the supplement copper at three levels (0, 10 and 20 mg/kg of DM) on the peripheral blood reproductive hormones (include E2,P,T,LH and FSH) secretion of Dabieshan heifers in estrus cycle. [Results] The results showed that E2 concentrations were increased significantly (P<0.01) and P concentrations were decreased significantly (P<0.01) by supplemental copper methionine at 20 mg/kg of DM than control group. At same time the recessive estrus rate decreased by supplemental copper methionine at 20 mg/kg of DM. Scores of estrus behavior rose from 4 to 8.125 and 75% heifers have normal estrus. [Conclusion] This indicated that copper sources had effects on reproductive hormone during estrus cycle, and it also have positive effects on prevent recessive estrus by supplemental copper at 20 mg/kg of DM in Dabieshan heifers.

Dabieshan heifer; copper Methionine; reproductive hormone; hiding estrous

2016-07-15

2016-07-20

安徽省农科院院长青年基金、现代农业(肉牛/ 牦牛)产业技术体系专项资金(CARS-38)、安徽省科技攻关计划。

徐磊(1986-)，男，河南息县人，助理研究员，主要从事肉牛育种研究。

*通讯作者：贾玉堂(1962-)，男，安徽界首人，副研究员，安徽省农科院畜牧所牛业研究室主任、国家肉牛牦牛产业技术体系合肥综合试验站站长。

S823

A

1001-9111(2016)06-0032-07