欧阳林旗 邓桂明 贺艳萍 肖小芹 陈镇 肖望重 何海

咳喘穴位贴散质量标准研究

欧阳林旗 邓桂明 贺艳萍 肖小芹 陈镇 肖望重 何海

目的 建立咳喘穴位贴散质量的标准。方法 采用薄层色谱法鉴别制剂中的麻黄、丁香、肉桂、甘遂；采用高效液相色谱法(HPLC)法测定盐酸麻黄碱。色谱柱为Agilent C18(4.6cm×250mm,5 μm),流动相为甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(磷酸调节pH=3.4)(10∶90),流速为1.0ml/min,柱温为25℃,检测波长为210 nm。结果 薄层色谱图斑点清晰,盐酸麻黄碱在5～50 μg范围内线性关系良好；其平均回收率为99.89%(RSD=0.79%,n=6)。结论 本法可用于咳喘穴位贴散的质量控制。

咳喘穴位贴散；薄层色谱法；高效液相色谱法；盐酸麻黄碱；质量标准

咳喘穴位贴散由麻黄、丁香、肉桂等组成。由于临床疗效明确、组方合理、深受广大患者欢迎,是中医药外治法治疗咳喘病标本兼顾的特色疗法。方药中麻黄的麻黄碱为有效成分［1］,为了更好的对贴散质量进行控制,本研究采用HPLC测定了贴散中盐酸麻黄碱的含量,并进行了方法学验证。现报告如下。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 Agilent 1260型高效液相色谱系统(美国Agilent公司),Sartorius BP211S型电子天平,高速多功能粉碎机,KDM型控温电热套,硅胶G板。

1.2 试剂 实验药材均购于湖南振兴中药饮片有限公司,经本院张志国教授鉴定,符合《中国药典》［2］规定。盐酸麻黄碱对照品由中国药品生物制品检定所提供。甲醇、乙腈为色谱纯试剂,水为蒸馏水,其余为分析纯试剂。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

2.1.1 麻黄薄层鉴别［3］取咳喘穴位贴散2 g,加浓氨水20滴,三氯甲烷10ml,加热回流1 h,过滤,挥干滤液,残渣加甲醇2ml充分振摇。过滤,取滤液,甲醇定容作为供试溶液。取缺麻黄的处方药材,按照处方比例取2.0 g,同法制备缺阴性对照溶液；对照品溶液为1mg/ml的盐酸麻黄碱甲醇溶液。按照药典薄层色谱法操作要求,吸取上述三种试液,分别点样于同一硅胶G薄层板上,展开剂：正丁醇-冰醋酸-水(8:2:1),显色剂：茚三酮试液。结果示在与对照品色谱相应的位置上,阴性无干扰,均为红色斑点。见图1A。

2.1.2 甘遂薄层鉴别［2］取咳喘穴位贴散2 g,置锥形瓶中,加乙醇30ml,超声30min后过滤,滤液蒸干,残渣加乙醇2ml溶解,即供试品溶液。同法制成缺甘遂阴性对照溶液。另取1.0 g甘遂对照药材,加10ml乙醇,同法制得对照药材溶液。吸取上述3种试液分别点样于同一硅胶G薄层板上,展开剂：甲苯-丙酮(10:1.2),显色剂：10%硫酸乙醇溶液,在365 nm紫外光灯下检视,供试品色谱图中,在与对照药材色谱图相应位置上,斑点颜色相同,阴性无干扰,位置一致。见图1B。

2.1.3 丁香薄层鉴别［2］取咳喘穴位贴散2.0 g,加石油醚(60～90℃)30ml,超声15min后过滤,挥干滤液,残渣加1ml甲醇溶解,即供试品溶液。同法制备缺阴性对照品溶液。另取丁香的对照药材1.0 g,加10ml石油醚(馏程60～90℃),超声15min后过滤,取滤液挥干,残渣加甲醇5ml溶解,即对照药材溶液。吸取上述三种试液,分别点样于同一硅胶G薄层板上,展开剂：石油醚(60～90℃)-甲醇(9:1),显色剂：5%香草醛硫酸溶液,在105℃烤箱加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,阴性无干扰,斑点颜色相同,位置一致。见图1C。

2.1.4 肉桂薄层鉴别［2］取咳喘穴位贴散2.0 g,加乙醇20ml,超声20min后过滤,滤液浓缩至5ml,作为供试品溶液。另取2.0 g肉桂对照药材,同法制成对照药材溶液。另取1.0 g缺肉桂阴性贴散,同法制备缺阴性试液,吸取上述三种试液,分别点样于同一硅胶G薄层板上,展开剂：石油醚(馏程60～90℃)-乙酸乙酯(17:3),喷显色剂：乙二硝基苯肼乙醇试液。365 nm紫外光灯下检视,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,阴性无干扰,斑点颜色相同,位置一致。见图1D。

图1 麻黄、甘遂、丁香、肉桂TLC谱图

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适应性实验 采用Aglient C18(254mm×4.6mm,10 μl),以甲醇为流动相A,0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(磷酸调节pH=3.4)(90:10)为流动相B,检测波长210 nm,流速1.0ml/min；柱温25℃［1］。

2.2.2 对照品溶液的制备 取盐酸麻黄碱对照品适量,精密称定,加甲醇制成40 μg/ml溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密称定贴散2.0 g,加浓氨试液20滴,再加二氯甲烷10ml,70℃回流1 h,过滤,滤液挥干后加甲醇2ml,振摇,过滤,取滤液加甲醇定容,即得。

2.2.4 缺阴性样品溶液的制备 精密称取按处方比例配制的缺麻黄贴散2.0 g,加浓氨试液20滴,再加二氯甲烷10ml,70℃回流1 h,过滤,滤液蒸干后加甲醇2ml充分振摇,滤过,取滤液,加甲醇定容,即得。精密吸取上述三种试液各10 μl,注入液相色谱仪,结果见图2。

图2 咳喘穴位贴片HPLC图

2.2.5 标准曲线的制备及线性关系考察 精密吸取盐酸麻黄碱对照品溶液0.5、1、2、3、4、5ml于5ml容量瓶中,用甲醇定容,分别吸取上述溶液各10 μl,进样,测定,以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线,盐酸麻黄碱对照品在5～50 μg内线性关系良好,其回归方程为：Y=4241.9X-1940.7(R2=0.9996)。

2.2.6 精密度试验 取盐酸麻黄碱对照品溶液10 μl,按照“2.2.1”项下色谱条件进样6次,测定结果显示RSD为1.03%,方法精密度符合要求。

2.2.7 稳定性试验 取同批次咳喘穴位贴散样品溶液,按照“2.2.1”项下色谱条件测定,吸取10 μl分别于1、2、4、8、12、24 h测定,结果表明RSD为0.92%,样品溶液在24 h内稳定。

2.2.8 重复性试验 取同批次咳喘穴位贴散样品溶液,按“2.2.1”项下色谱条件方法,分别进样6次,测定结果表明：盐酸麻黄碱平均含量为365.3 μg/g,RSD为0.96%,表明方法重现性好。

2.2.9 加样回收率试验 精密称取已知含量的同批样品5份,每份2.0 g,精密量取40 μg/ml盐酸麻黄碱1.0ml,按“2.2.3”项下方法处理,测定。见表1。

2.2.10 样品含量测定 精密分别称取3批样品,按“2.2.3”项下方法制备咳喘穴位贴散样品溶液,按上述色谱条件进行测定,3个批次咳喘穴位贴散样品溶液中盐酸麻黄碱的含量为365.4、359.8、357.7 μg/g。见表2。

表1 加样回收试验

表2 样品含量测定

3 讨论

麻黄薄层色谱法鉴别中,参照药典方法采用三氯甲烷:甲醇:浓氨水(20:5:0.5)为展开剂,样品溶液拖尾严重,结果分离效果不好,现采用正丁醇-冰醋酸-水(8:2:1)为展开剂展开,效果理想。同理,丁香也曾采用石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(9:1)为展开剂,结果分离效果不好,现采用石油醚(60～90℃)-甲醇(9:1)为展开剂,效果理想,其余均依据药典要求。

为更好地控制制剂质量,对其中君药麻黄中盐酸麻黄碱做HPLC的含量测定,测得结果表明,本方制剂中盐酸麻黄碱的含量≥300 μg/g,方法可靠、专属性强、重复性好,可为该制剂的质量评价提供合理的依据。

［1］邓桂明,陈镇,杨广民,等.超临界CO2萃取咳喘穴位贴片药材的工艺研究.中国医院药学杂志,2007,27(11):1493-1497.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部).北京:中国医药科技出版社,2015:4,8,136-137,320-321.

［3］彭飞城,丁野,郑金凤,等.小儿麻甘颗粒质量标准的建立.中国药师,2012(11):1559-1561.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.11.204

2016-03-18］

湖南省中医药科研计划重点项目(项目编号：201443)；湖南省教育厅重点项目(项目编号：13A067)

410007 湖南中医药大学第一附属医院(欧阳林旗邓桂明 陈镇 肖望重 何海)；湖南中医药大学(贺艳萍 肖小芹)

邓桂明