俞榕，沈迎春

依维莫司对胃癌细胞株生长、迁移和侵袭的作用研究

俞榕，沈迎春

目的探讨依维莫司对胃癌细胞HGC-27和KATO III生长、迁移和侵袭的作用。方法采用MTT试验检测两种胃癌细胞在不同浓度依维莫司作用下的生长状况，并计算出相应的IC50值；采用流式细胞仪技术检测依维莫司作用后细胞周期状况；采用Annexin V/PI双染法检测依维莫司作用后细胞凋亡状况；采用Transwell法检测依维莫司作用后细胞的迁移和侵袭能力变化；采用Western blot法检测两种细胞的mTOR蛋白表达水平。结果依维莫司显著抑制HGC-27细胞和KATO III细胞的生长，并且这种抑制作用具有浓度依赖性；依维莫司诱导HGC-27细胞和KATO III细胞发生G1期阻滞；依维莫司诱导KATO III细胞发生凋亡，但不诱导HGC-27细胞发生凋亡；依维莫司抑制HGC-27细胞和KATO III细胞的迁移和侵袭能力；mTOR蛋白在HGC-27和KATO III细胞中均有表达。结论依维莫司可以显著抑制胃癌细胞的生长、迁移和侵袭，可以作为临床上治疗胃癌，预防胃癌复发的靶向药物。

胃肿瘤；癌；依维莫司

目前我国每年约40余万成为胃癌新患者，而约30余万胃癌患者死亡［1］。虽然外科手术已成为胃癌最主要的治疗手段，但部分患者仍需行化疗以延长生存期，降低复发率。目前靶向治疗药物在肿瘤治疗中吸引着众人的眼球。本研究检测目前临床上常见的靶向药物mTOR抑制剂依维莫司对胃癌细胞株HGC-27［2］和KATO III细胞［3］生长、迁移和侵袭的作用。现将结果报道如下。

1　资料与方法

1.1材料人胃癌细胞株 HGC-27和KATOIII均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；依维莫司购自瑞士novartis公司；RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自美国Hyclone公司；青链霉素购自美国Sigma公司；MTT试剂购自美国Sigma公司；AnnexinV-FITC双染色试剂盒购自美国Invitrogen公司；Transwell细胞培养小室购自美国corning公司；抗mTOR单克隆抗体购自美国santacruz生物公司；蛋白提取试剂盒购自美国BD公司；羊抗鼠二抗购买自美国KPL公司；ECL化学发光试剂盒购买自美国Pierce公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养将人胃癌细胞株HGC-27和KATOIII培养在10 cm培养皿中，细胞均采用RPMI 1640培养基进行培养，RPMI 1640培养基中需添加10%胎牛血清和1%青链霉素。细胞培养在37℃，含5%CO2、95%空气的恒温培育箱中。细胞培养基每天更换，当细胞生长至70%～80%汇合程度时即予以0.25%的胰蛋白酶消化，然后以1∶3的比例接种至3个新的培养皿中。

1.2.2MTT试验将处于对数生长期的两种胃癌细胞接种消化接种至96孔板，保持每孔细胞数目约5×103个。在细胞培育过夜后，分别加入不同浓度的依维莫司（0、1、2、4、8、16、32 mol/L）。在药物处理72 h后，去除含有药物的培养基，PBS冲洗细胞，加入MTT溶液；在细胞与MTT溶液共同孵育4 h后，去除MTT溶液，加入DMSO溶液。然后振荡混匀，在37℃孵育10 min。上酶标仪检测490 nm处的吸光值。根据MTT结果测算出IC50值，在后续实验中依维莫司采用IC50值的浓度进行。

1.2.3流式细胞仪检测细胞周期采用流式细胞仪检测细胞周期，选取对数生长期的HGC-27和KATO III细胞接种于6孔板培育过夜。分别加入0、10、20、30、40 mmol/ml依维莫司，在药物作用72 h后收集细胞，预冷的70%乙醇在4℃下固定细胞过夜，然后分别加入PI（终浓度50 g/ml）和冰冷RNA酶（终浓度50 g/ml）染色0.5 h，样本上流式细胞仪进行检测，采用 Flowjo软件对流式细胞仪数据进行分析。

1.2.4流式细胞仪检测细胞凋亡采用Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡情况，所有操作按照说明书进行。选取对数生长期的HGC-27和KATO III细胞接种于6孔板培育过夜。分别加入0、10、20、30、40 mmol/ml依维莫司，在药物作用72 h后收集细胞，PBS冲洗细胞后，分别在避光条件下加入Annexin VFITC试剂和PI试剂进行双染色0.5 h。然后在1 h内上流式细胞仪进行检测。

1.2.5细胞迁移和侵袭试验采用Transwell小室试验检测细胞迁移和侵袭情况。选取药物处理48 h和药物未处理的HGC-27和KATO III细胞接种于Transwell小室的上室（迁移试验）或铺有基质胶的上室（侵袭试验），然后采用无血清培养基进行培养，在Transwell小室的下室加入含15%胎牛血清的培养基。在培养72 h后，去除小室中培养基，PBS冲洗后甲醇固定20 min，0.1%结晶紫染色15 min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞和基质胶。然后在光镜下技术染色的细胞数目。

1.2.6western blot检测mTOR的表达水平首先采用蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，然后采用BCA法进行蛋白定量。取30g蛋白进行变性后，上样到10%的SDS-PAGE胶，进行电泳1 h；然后采用丽春红进行胶染色，在确定有蛋白条带后用PVDF膜转膜1 h；将附有蛋白的膜采用脱脂奶粉封闭，然后分别加入相应的抗 mTOR单克隆一抗（1∶1 000），在4℃下孵育过夜，然后加入二抗（1∶5 000）在室温下孵育1 h，然后采用 ECL发光试剂盒在暗室中进行荧光发光，并用胶片进行显影和定影。本实验采用 -actin蛋白作为内参照。

1.2.7统计方法所有数据采用 SPSS 11.0进行统计分析，计量资料采用均数±标准差的形式表示；多组比较采用单因素方差分析分析，两组比较采用 检验。＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1依维莫司抑制 HGC-27细胞和KATOIII细胞的生长通过MTT试验，发现依维莫司处理72 h对两种胃癌细胞HGC-27和KATO III都有显著的生长抑制作用，并且这种生长抑制作用具有浓度依赖性。药物浓度越高，生长抑制作用越显著（封二彩图4）。依维莫司对HGC-27和KATO III细胞的IC50值分别为1.606 mol/L和5.944 mol/L。在后续实验中，本研究采用的依维莫司浓度分别为两种细胞所计算出的IC50值。

2.2依维莫司诱导 HGC-27细胞和KATOIII细胞发生G1期阻滞通过流式细胞仪检测细胞周期，笔者发现在依维莫司作用72 h后，HGC-27和KATO III细胞出现了G1期阻滞，表现为G1期细胞比例增高（=7.521、9.195，均＜0.05），S和G2期细胞相对减少。其中药物处理组HGC-27细胞G1期比例为（72.71±1.83）%，对照组 G1期比例为（61.67±1.76）%；药物处理组KATOIII细胞G1期比例为（73.51±1.69）%，对照组G1期比例为（60.64±1.74）%。

2.3依维莫司诱导KATO III细胞发生凋亡通过流式细胞仪检测细胞凋亡，发现依维莫司作用72 h后，KATOIII细胞发生显著的凋亡（=10.601，＜0.05），药物处理组KATOIII细胞凋亡比例为（28.30±1.99）%，对照组凋亡比例为（9.79±2.27）%；另外，依维莫司并不诱导HGC-27细胞发生凋亡，药物处理组细胞凋亡比例（［9.32±1.24）%］和对照组细胞凋亡比例（［8.96%±0.90%）］差异无统计学意义（=1.006，＜0.05）。

2.4依维莫司抑制 HGC-27细胞和KATOIII细胞的迁移和侵袭能力通过Transwell迁移和侵袭试验，发现依维莫司作用72 h后，HGC-27细胞和KATO III细胞的迁移能力和侵袭能力显著降低，表现为两种细胞穿过Transwell膜的数目显著少于对照组。迁移试验中药物处理组穿膜的 HGC-27细胞数量为（123.7±28.4）个，对照组为（238±43.9）个，差异有统计学意义（=3.785，＜0.05）；药物处理组穿膜的KATOIII细胞数量为（139.7±27.6）个，对照组为（231.3±48.2）个，差异有统计学意义（=2.858，＜0.05）。侵袭试验中药物处理组穿膜的HGC-27细胞数量为（67±4.6）个，对照组为（198±9.6）个，差异有统计学意义（=21.251，＜0.05）；药物处理组穿膜的KATOIII细胞数量为（63.3±1.5）个，对照组为（151.3±29.3）个，差异有统计学意义（=5.202，＜0.05）。

2.5mTOR蛋白在HGC-27和KATO III细胞中的表达水平通过 western blot实验，笔者检测了 mTOR蛋白在HGC-27细胞和KATOIII细胞中的表达水平。结果显示，mTOR蛋白在两种胃癌细胞中均有表达。见封二彩图5。

3　讨论

依维莫司是雷帕霉素的衍生物，也是mTOR蛋白抑制剂，多项研究表明其具有抗肿瘤的作用，2012年新英格兰医学杂志就曾报道过依维莫司应用于雌激素阳性的绝经妇女乳腺癌患者的三期临床试验，取得了较好的疗效［4］。另有研究发现依维莫司可作为转移性肾癌患者在应用血管内皮生长因子受体（VEGFR）酪氨酸激素抑制剂如贝伐单抗等治疗失败后的替代药物，并可收到较好的疗效［5］。但目前关于依维莫司在胃癌治疗中的作用尚存在争议，一些研究认为依维莫司可以显著延长一部分胃癌患者生存期［6］，而一些研究认为依维莫司无法显著延长胃癌患者生存期［7］。

本研究通过基础实验探讨依维莫司对胃癌细胞株HGC-27和KATO III的作用。依维莫司是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的特异性抑制剂，可以显著抑制 mTOR的活性及其介导的下游通路。通过western blot试验，笔者发现mTOR在两种细胞中均正常表达，表达水平差异无统计学意义。通过MTT试验，笔者发现依维莫司在体外可以显著抑制HGC-27和KATOIII细胞的增殖，并且这种抑制作用具有浓度依赖性。HGC-27属于未分化胃癌细胞，KATOIII属于低分化胃癌细胞。未分化癌细胞通常对于化疗药物更敏感，在研究中笔者发现依维莫司对HGC-27细胞的半数致死浓度（IC50）值更低。

目前已知依维莫司可能通过以下三种途径抑制细胞生长：诱导周期阻滞［8］、诱导细胞凋亡［9］和促进细胞自噬［10］。笔者通过细胞周期检测发现，依维莫司可以诱导两种胃癌细胞均发生G1期阻滞。这与他人结果相符合，说明依维莫司可以通过调控细胞周期进程而抑制细胞生长。依维莫司诱导细胞周期阻滞的机制主要依赖于其作为mTOR抑制剂，可以与mTOR结合，抑制mTOR的活性，然后激活ERK/MAPK信号转导通路，下调周期相关蛋白cyclinD1表达，上调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CKI）如p21、p27等蛋白的表达，诱导周期进程阻滞，导致生长阻滞［11］。目前研究发现，依维莫司除了可以诱导周期阻滞外，还可以诱导细胞凋亡。本研究发现，依维莫司可以诱导KATOIII细胞凋亡，却不能诱导HGC-27细胞凋亡，说明依维莫司可能通过调控细胞周期而发挥抑制HGC-27细胞生长的作用，而依维莫司对于KATOIII细胞生长的调控可能涉及周期阻滞和细胞凋亡两个方面。

除此之外，笔者还发现依维莫司显著抑制HGC-27和KATOIII细胞的迁移和侵袭，这与前人在其他肿瘤中的研究结果相仿［12］，说明依维莫司可以调控肿瘤细胞的迁移和侵袭特性，但其中的具体分子机制却未见报道，有待以后实验的阐明。

总之，依维莫司可以作为治疗胃癌的潜在药物，但其具体疗效和副作用仍有待大规模临床试验验证。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.04.033

R735.2

A

1671-0800（2016）04-0478-03

2015-02-08

（本文编辑：姜晓庆）

330200宁波，鄞州区集市港镇卫生服务中心（俞榕）；宁波市医疗中心李惠利医院（沈迎春）

俞榕Email：huangjie1981_ 1981@163.com