李娇娇，杨茹

连云港市第一人民医院，江苏连云港222000



DNA甲基化与动脉粥样硬化的研究进展

李娇娇，杨茹

连云港市第一人民医院，江苏连云港222000

研究表明表观遗传学改变参与了动脉粥样硬化的发病机制。其中DNA甲基化研究最为广泛。该综述主要关注参与动脉粥样硬化过程的基因，包括与内皮功能紊乱有关的一氧化氮合成酶、雌激素受体、XV型胶原α1和10-11易位蛋白；受高胆固醇和同型半胱氨酸水平调节的p66shc、凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1及载脂蛋白E；与动脉炎症反应有关的干扰素γ、叉头框p3及肿瘤坏死因子-α。

DNA甲基化；动脉粥样硬化；表观遗传学

动脉粥样硬化是一种血管壁脂肪聚集导致的慢性炎症反应。很多证据提示表观遗传学改变参与了动脉粥样硬化斑块的发生发展及其相关疾病的发病过程。调节基因沉默与激活的主要表观遗传机制包括DNA甲基化、组蛋白修饰及RNA机制。其中DNA甲基化研究最为广泛。DNA甲基化一般是通过DNA甲基转移酶（DNMTs）导致化学稳定的表观遗传学修饰并抑制基因的表达。该综述主要关注动脉粥样硬化过程中发生表观遗传学修饰的基因，包括与内皮功能紊乱有关的一氧化氮合成酶（NOS）、雌激素受体（ERs）、XV型胶原α1（COL15A1）和10-11易位（TET）蛋白；受高胆固醇和同型半胱氨酸（Hcy）水平调节的p66shc、凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1（LOX1）及载脂蛋白E（APOE）；与动脉炎症反应有关的干扰素γ（IFN-γ）、叉头框p3（FOXP3）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。

1　内皮功能紊乱与DNA甲基化

在动脉粥样硬化过程中，表观遗传机制可发生在正常动脉壁含量最丰富的内皮细胞和血管平滑肌细胞（smooth muscle cells，SMC）。正常情况下它们处于静止状态，细胞增殖和基质合成率低。当血管损伤时，SMC表现出显著的表型可塑性，并通过迁移、增殖、合成基质、凋亡、炎症、摄取胆固醇等方面促进动脉粥样斑块的形成。研究发现主要的心血管危险因素，如糖尿病、高血压和血脂异常等都可影响SMC表型，也提示了SMC在动脉粥样硬化发展中的作用。许多研究提示SMC中发生广泛的表观遗传学改变。使用影响血管细胞表观遗传途径的药物有可能成为治疗血管疾病的新途径。

内皮的eNOS（endothelial NOS，eNOS）由NOS3基因编码，它是内皮基因受染色质可接近性调控的最好例子。NOS3启动子区的染色质结构在内皮细胞处于转录容许状态，而在非内皮细胞则为抑制状态。生理状态下，内皮细胞中NOS3启动子区发生低甲基化。而在非表达的细胞型如SMC中，则发生DNA高甲基化。动脉粥样硬化斑块中内皮细胞NOS3的信使RNA（messenger RNA，mRNA）被下调。但在包括SMC在内的大多数晚期斑块组织中，NOS3与编码诱导型NOS（inducibleNOS，iNOS）的NOS2，编码神经型NOS（neuronal NOS，nNOS）的NOS1的mRNA均被上调。因此DNA甲基化在特定细胞中调控NOS的正确转录方面起着非常重要的作用。药物抑制试验也证实了NOS3启动子功能的重要性。用一种DNMT抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷（5-aza-2-deoxycytidine，DAC）处理SMC后，发现NOS3的mRNA水平被上调。另外，最近一项评估儿童NOS1 DNA甲基化的增加与颈动脉内膜中层厚度之间关系的研究表明，NOS1 DNA甲基化通过调节NO的产生，有可能成为动脉粥样硬化的生物标志物。

DNA甲基化还影响表征血管老化和动脉粥样硬化的ERs表达。事实上ERα和ERβ被认为是人动脉保护基因，调节雌激素对内皮细胞和SMC的保护作用。ERα的缺乏导致男性动脉粥样硬化的加速进展。离体的人冠状动脉粥样硬化组织和升主动脉斑块区域中衰老的内皮细胞和SMC的ERα和ERβ均发生高甲基化。主动脉SMC中编码COL15A1蛋白的基因表达亦受DNA甲基化的影响。COL15A1启动子区呈低甲基化，则其转录和蛋白表达水平增高，促进人主动脉粥样硬化的发展。SMC和内皮细胞中也表达编码组织因子途径抑制物-2（tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI-2），又称胎盘蛋白的基因。它与细胞外基质有关，抑制多种参与凝血、纤溶和细胞外基质降解等机制的丝氨酸蛋白酶。约30%的动脉粥样硬化斑块中TFPI-2基因发生高甲基化，并伴随mRNA水平的显著降低。相反，作为对照的正常乳腺动脉中TFPI-2则呈高表达。因此，TFPI-2基因甲基化过程可能与斑块的稳定性有关。

最近的一项研究表明TET蛋白在DNA去甲基化方面发挥重要的调节作用。TET蛋白家族通过使相关基因的5-甲基胞嘧啶转化为5-羟甲基胞嘧啶，从而诱导DNA去甲基化并激活基因转录。TET2通过直接调节靶基因，如心肌素（MYOCD）、血清反应因子（SRF）和肌球蛋白-11（MYH11）的染色质可接近性来诱导SMC分化。这些表观遗传变化对在体及离体的SMC表型产生影响，增加了SMC的可塑性。从轻、中、重度动脉粥样硬化患者的冠状动脉活检中发现，TET2的过表达与MYOCD蛋白水平的增加有关。而TET2敲减则可抑制MYOCD和SRF的表达，从而防止SMC转化成收缩表型、血管损伤及动脉粥样硬化的发生。

近期的一项全基因组DNA甲基化分析研究，比较了动脉粥样硬化斑块病变组织与相应的无斑块组织以确定与动脉粥样硬化有关的低甲基化和高甲基化基因。果蝇headcase（HECA）、早期B细胞因子1（EBF1）和核苷酸结合寡聚化结构域2（NOD2）基因发生低甲基化。而人丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶4（MAP4K4）、锌指E盒结合同源框1（ZEB1）及FYN基因则发生高甲基化。进一步提示DNA甲基化参与了动脉粥样硬化的发病机制［1］。

2　高胆固醇、高Hcy水平与DNA甲基化

外周血白细胞全基因组DNA甲基化分析是一种很好的评估动脉粥样硬化风险的生物标志。2002年Hiltunen MO的研究团队第一次从载脂蛋白E缺陷（ApoE-/-）小鼠和气囊裸露模型的新西兰大白兔动脉粥样硬化损伤处，检测到基因组5-甲基胞嘧啶含量显著下降。随后检测到ApoE-/-小鼠外周血单核细胞与主动脉全基因组DNA均呈低甲基化［2］。

p66shc是高胆固醇血症导致基因表观遗传修饰的一个典型例子。它在高胆固醇血症小鼠中介导内皮氧化应激和脂质条纹形成。低密度脂蛋白（Low-density lipoprotein，LDL）胆固醇使内皮细胞p66shc启动子发生低甲基化，从而促进内皮功能紊乱。另外一个受影响的基因是参与血管内皮稳态的转录因子Kruppel样因子2（Kruppel-like factor 2，KLF2）。LDL通过DNA甲基化减少人内皮细胞KLF2的表达，下调它的靶基因，如血栓调节蛋白、eNOS和纤溶酶原激活物抑制剂1。此外，LDL胆固醇可以使血管保护基因如凝集素样氧化低密度脂蛋白受体1（lectin-like oxLDL receptor，LOX1）的启动子区发生高甲基化。OxLDL诱导LOX1启动子高甲基化，并抑制其表达。OxLDL通过DNA甲基化对血管内皮细胞进行表观遗传修饰并导致晚期斑块的凋亡抵抗。

在家族性高胆固醇血症（familial hypercholesterolemia，HF）病人中，低密度脂蛋白受体（The low-density lipoprotein receptor，LDLR）基因通过调节LDL颗粒的内吞在胆固醇稳态方面起重要作用。LDLR基因甲基化异常参与了动脉粥样硬化的发生发展。Guay SP等［3］在患有早期动脉粥样硬化的FH患者中证实了基因多态性，他们发现在胆固醇酯转移蛋白（cholesteryl ester transfer protein，CETP）和脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase，LPL）启动子基因位点存在个体间表观基因差异，并且与血脂质谱变异性有关。此外，在动脉粥样硬化患者外周血中发现LDLR和卵磷脂-胆固醇酰基转移酶基因启动子区的DNA甲基化水平存在变异性。新的基因多态性如ABCG1、LIPC和PLTP的DNA甲基化与FH患者的HDL-C、LDL-C、甘油三酯水平有关，并促进了血浆脂质水平的变异性。主要的脂蛋白代谢基因的表观遗传学改变与血浆脂质水平有关，导致个体间差异。这至少部分解释了FH患者中血浆脂质水平的遗传性缺失现象。

1999年纽曼研究团队猜测异常的DNA甲基化可能控制动脉粥样硬化进程，并猜测其与Hcy含量增加有关［4］。血Hcy水平增高是动脉粥样硬化的独立危险因素。HHcy可导致NO、VEGF和Akt生成减少，血管发生中断，SMC增殖，血脂异常，血管氧化应激和内皮损伤。HHcy还诱导一些基因特异性启动子甲基化，并改变其调节的基因表达。在人内皮细胞中，Hcy通过抑制DNMT1、DNA低甲基化和组蛋白乙酰化诱导细胞周期蛋白A基因沉默和生长抑制。HHcy在冠心病患者中诱导全基因组DNA高甲基化，但在晚期动脉粥样硬化的人、兔、鼠血管组织和外周血细胞中则发生全基因组DNA低甲基化。另外有研究表明，循环Hcy水平与动脉粥样硬化中DNA甲基缺失呈显著相关性。以上这些研究提示DNA甲基谱的改变可能成为动脉粥样硬化的早期标志，并可能在动脉粥样硬化发生中起致病作用。

另外，有研究提示Hcy可诱导白细胞端粒静止和缩短。在动脉粥样硬化患者中白细胞端粒长度（leukocytetelomere length，LTL）缩短，加速了内皮细胞或祖细胞的衰老。一项流行病学研究也报道了血清Hcy水平的增高与人LTL缩短相关。在HHcy动脉粥样硬化患者和小鼠模型中的研究提示，hTERT启动子DNA去甲基化可能成为Hcy诱导的动脉粥样硬化的表观遗传调控的靶基因。研究者发现高血Hcy水平能诱导DNA去甲基化并下调hTERT从而导致LTL缩短。这一研究发现了Hcy介导的端粒酶失活的新机制，独立于已知的通过NADPH氧化酶介导的NO水平降低并增加氧化应激。

3　在冠心病患者中，二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶2

（dimethylargininedimethylaminohydrolase2，DDAH2）启动子高甲基化可能与内皮祖细胞（endothelial progenitor cell，EPC）功能紊乱有关。Hcy可通过DDAH2启动子高甲基化损害EPC粘附功能，而这种作用可被Aza（DNMT抑制剂）预处理所逆转。这些结果也印证了DNA甲基化在动脉粥样硬化进展中的作用。

近期，人动脉粥样硬化DNA甲基化地图的绘制已可用于鉴定参与动脉粥样硬化的发生及内皮和SMC功能的异常甲基化CpG。在动脉粥样硬化病变处观察到的DNA甲基化增加，使应用DNA去甲基化药物治疗动脉粥样硬化成为可能。

4　动脉粥样硬化炎症反应与DNA甲基化

众所周知，动脉粥样硬化是血管慢性炎症反应性疾病。单核细胞衍生的巨噬细胞与特异性T细胞决定了动脉粥样硬化相关的免疫反应［5］。在动脉粥样硬化小鼠模型中已证实促炎细胞因子在动脉粥样硬化的发展中起关键作用。事实上，编码促炎细胞因子（如IL-12、IFN-γ、IFN-γ受体、TNF-α）的基因缺失可减少这些基因敲除鼠的动脉粥样硬化发生。

在动脉粥样硬化斑块中存在几个从同一幼稚前体T细胞衍生的T细胞亚型，主要是CD4+T细胞和一些CD8+T细胞。迄今为止，在体和离体实验表明表观遗传调控发生在CD4+T细胞分化成Th1、Th2或者血管保护的调节T细胞表型的过程中。在人动脉粥样硬化斑块早期主要存在产生IFN-γ的Th1-T细胞。Th2-T细胞通常被认为是抗动脉粥样硬化的。调节T细胞（Treg）则控制Th1/Th2的平衡。参与动脉粥样硬化过程的炎症因子如IFN-γ、PDGF和ICAM-1基因的表达可能受DNA甲基化调控［6-7］。Th1细胞中IFN-γ位点通过DNA甲基化重塑可调控IFN-γ的表达。研究发现在DNMT敲除小鼠和应用DNMT抑制剂的T细胞中IFN-γ的表达增加。

DNA甲基化调控也发生在FOXP3启动子区。FOXP3是Treg细胞中控制CD4+-Th1/Th2分化的主要转录因子。Treg细胞与非Treg CD4+细胞相比，FOXP3启动子呈现不同的甲基化水平。从急性冠脉综合征患者中分离出的外周血单个核细胞，用OxLDL处理后，DNA甲基化程度增加。体外研究表明OxLDL通过上调DNMT活性使DNA高甲基化从而抑制FOXP3的表达。因此，Treg细胞可能在人急性冠脉综合征中发挥重要的保护作用，下调Treg细胞将增加动脉粥样硬化的风险。

血单核细胞趋化蛋白1（Blood monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）在炎症反应及动脉粥样硬化早期形成阶段发挥重要作用。HHcy可诱导MCP-1介导的动脉粥样硬化炎症反应。一些研究提示在HHcy影响下，MCP-1启动子DNA低甲基化可能通过NF-κB/DNMT1信号途径诱导动脉粥样硬化斑块形成［8］。离体实验通过使用NF-κB抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸酯证实了这种作用。NF-κB抑制剂处理使NF-κB水平下调而DNMT1含量提高。

5　结论和展望

许多研究支持表观遗传改变参与了早期动脉粥样硬化的发病机制。涉及参与动脉粥样硬化过程不同阶段的基因，尤其是参与内皮功能紊乱、炎症反应及受高胆固醇和Hcy水平调节的基因。其中DNA甲基化研究最为广泛。然而目前大部分数据来自体外研究或者有关动脉粥样硬化形成的在体模型研究。仍然缺乏临床试验数据的支持。DNA甲基化的改变是可逆的，这就为基于DNA甲基化的治疗提供了乐观的前景。深入的研究DNA甲基化将有利于对动脉粥样硬化发病机制的认识和治疗措施的改进。

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Research Progress of DNA Methylation and Atherosclerosis

LI Jiao-jiao，YANG Ru
Lianyungang First People's Hospital，Lianyungang，Jiangsu Province，222000 China

The research shows that the genetics change is involved in the pathogenesis of atherosclerosis，and the DNA methylation research is most wide，the paper mainly discusses the genes involved in the atherosclerosis process，including nitric oxide synthetase，estrogen receptor，type XV collagen α1 and 10-11 translin related to the endothelial disfunction，p66shc adjusted by hypercholesterolemia and coronary heart disease level，lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1 and apolipoprotein E，interferon γ，forkhead box p3 and tumor necrosis factor-α related to the artery inflammatory reaction.

DNA methylation；Atherosclerosis；Epigenetics

R543.5

A

1672-5654（2016）09（a）-0186-04

10.16659/j.cnki.1672-5654.2016.25.186

2016-06-10）

李娇娇（1987-），女，江苏东海人，博士研究生，住院医师，研究方向：脑血管病。