王伟丞，梁海英，曾智勇，汤德元，刘　钊，代振江（.贵州大学动物科学学院，贵州贵阳550025；2.贵州省动物疫病预防控制中心，贵州贵阳550008）



猪圆环病毒2型感染性克隆疫苗的研究前景

王伟丞1，2，梁海英1，曾智勇1，汤德元1，刘钊1，代振江1
（1.贵州大学动物科学学院，贵州贵阳550025；2.贵州省动物疫病预防控制中心，贵州贵阳550008）

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV-2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的主要病原，此外还与猪皮炎与肾病综合征、仔猪先天性震颤、流产和渗出性皮炎等有关，这些疾病统称为猪圆环病毒病。该病广泛流行于世界各地，在我国猪群中流行较为严重，临床上常与猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟和猪细小病毒等混合感染，继发感染，给养猪业造成了巨大的经济损失。目前，疫苗接种是防控PCV-2的有效手段，国内外学者对其进行了大量研究，其中灭活疫苗和亚单位疫苗是目前的商品化疫苗，这些疫苗的应用为PCV-2感染的控制发挥了重要的作用，但免疫效果仍有待进一步提高[1-3]。其中灭活疫苗对机体的刺激时间比较短，需要多次接种，效果欠佳，而且PCV-2在细胞上增殖滴度低，其疫苗制备费用较高；亚单位疫苗由于体积较小，免疫原性不如全病毒的效果，且研究和开发的费用较为昂贵，在我国的研究相对较为薄弱。因此开发新型疫苗成为目前的主要研究热点。

1　新型疫苗研究现状

由于灭活疫苗和亚单位疫苗的成本高，注射次数多，易造成机体应激，因此，弱毒疫苗，活载体疫苗和核酸疫苗等新型疫苗成为研究热点。但是弱毒疫苗是将病原体通过自然筛选或人工致弱等方式减弱制备而成。尽管这类疫苗的毒力已经致弱，但仍然保持着原有的免疫原性，并能在动物体内繁殖，刺激动物机体免疫系统，从而诱导机体产生免疫力和保护力。但目前还没有商品化的弱毒疫苗，主要原因可能是与病毒毒力易返强、致弱毒株毒力评价困难等原因相关[4]。将病原微生物的免疫原性基因插入细菌或病毒等活载体中，可产生一种常规活疫苗和灭活苗主要优点的基因工程活载体疫苗，特别是病毒载体还可以诱导常规灭活疫苗不能诱发的CD8＋T细胞应答，因而该类基因工程疫苗具有很大的发展前景。但是活载体疫苗也存在一些不足，如腺病毒载体不能形成外源基因的稳定表达；靶向性差；腺病毒颗粒可被肝脏的Kupffer细胞非特异性吸收，表现出很强的首过效应等。以猪繁殖与呼吸综合征病毒构建的活载体疫苗存在体外是否稳定、目的基因经传代是否会丢失等问题仍有待进一步的试验数据加以证实[4]。

核酸疫苗作为一种新型的基因工程疫苗，因免疫效果好，免疫应答持久，制备简便，稳定性强，安全性好，成本低廉，适于规模化生产等优点，现已成为免疫学领域研究的热点。其原理是将携带有免疫原编码基因的真核表达质粒直接导入动物体内，通过宿主细胞的表达系统合成免疫原蛋白，进而诱导免疫应答。含PCV-2 ORF2基因的质粒载体能够诱导仔猪产生抗PCV-2感染的保护性免疫应答[5]。Aravindaram等[6]分别构建了含PCV-2-ORF1、-ORF2、-ORF3的重组质粒，将其单独或联合免疫小鼠2周后，结果发现ORF-2/-3与ORF-1/-2/-3这2种组合免疫诱导产生的IFN-γ、TNF-a、GM-CSF以及PCV-2抗体水平均较其他免疫组高，攻毒后这2种组合免疫组PCV-2病毒载量显著减少，小鼠的肺部病变也明显减轻。Fan等[7]通过构建4种不同Cap蛋白定位的DNA疫苗载体探讨了DNA疫苗免疫及Cap蛋白的定位对诱导免疫应答的影响，结果表明，4种DNA疫苗免疫均能诱导PCV-2特异性的体液免疫，但分泌型Cap蛋白诱导更高的中和抗体，且降低了IFN-γ水平，而膜定位Cap蛋白则使IFN-γ升高，由于IFN-γ能促进PCV-2的复制，当PCV-2感染时，DNA疫苗免疫诱导的高水平IFN-γ存在潜在的危险，因此，表达分泌型Cap蛋白的DNA疫苗是较好的选择。尽管核酸疫苗具有诸多优点，但外源基因在体内的表达调控及其在体细胞中的转移可能会产生意外的免疫病理反应等问题，使得目前绝大部分核酸疫苗的研究还仅局限于实验室。

2　感染性克隆疫苗研究现状

感染性克隆疫苗是一种新型的核酸疫苗，是将毒力损失或毒力致弱的病毒制成核酸疫苗后免疫动物，获得与自然毒相同的免疫效果[8]。与以往的核酸疫苗相比，感染性克隆疫苗即具有核酸疫苗的优点，又克服了核酸疫苗表达量低的缺点。因感染性克隆疫苗是作为一种毒力减弱的活毒进入机体内的，具有正常的生理周期，却又没有致病性或致病力很弱，所以在体内的表达量要远远高于以往的核酸疫苗。随着猪圆环病毒2型感染性克隆的成功构建，对PCV-2基因组的背景有了清楚的认识，对各基因的功能也更加清楚。在此基础上，不再局限于仅仅利用免疫原性基因构建核酸疫苗，而是通过构建PCV-2的感染性克隆，在此基础上利用基因缺失、突变、嵌合等反向遗传操作技术将这种感染性病毒致弱，使其对宿主细胞蛋白表达系统的抑制作用接触，但保留了野毒的免疫原性及其正常的增殖能力。

Fenaux等[9]于2002年开始PCV-2感染性克隆的研究，其将两个拷贝的PCV-2基因组以首尾相连的方式克隆入pBluescript SK质粒，构建PCV-2的感染性克隆。该DNA克隆在PK-15细胞内能产生具有感染性的PCV-2病毒粒子。进一步将其重组质粒直接注射SPF猪体内，发现其与接种PCV-2野毒组的SPF猪具有同类型的临床症状和病理变化，为PCV-2感染性克隆疫苗的研究和应用奠定了基础。Fenaux等[10]于2004年进一步构建了具有PCV-2免疫原性减毒的PCV1-2嵌合病毒，即以PCV-1为骨架，以PCV-2的Cap基因（ORF2）取代PCV-1的ORF2；同时，也构建了PCV2-1的嵌合基因组作为对照，即以PCV-1 ORF2取代PCV-2基因组中的ORF2；将这两种DNA克隆转染PK15细胞均具有感染性，且PCV1-2病毒能够诱导PCV-2核衣壳蛋白的特异性抗体反应，但其毒力明显降低，因此PCV1-2感染性克隆质粒可以作为有效防止PCV-2感染和PMWS流行的疫苗。同时Fenaux等[11]还在PCV-2的体外传代过程中发现其核衣壳蛋白中存在有与病毒体外复制和体内毒性作用有关的两个氨基酸突变，这两个氨基酸的突变提高了PCV-2的体外增殖能力但却降低了其在体内的毒性作用，也为PCV-2疫苗的研制提供了思路。金玉兰等[12]构建了ORF2内的单核苷酸缺失突变体感染性克隆，发现1376位点核苷酸的缺失提高了PCV-2的致病性和免疫抑制能力。Karuppannan等[13]构建了ORF3突变的重组PCV-2，接种断奶仔猪后不引起明显的临床症状，与野毒相比，病毒血症、淋巴结病理变化以及抗原载量明显减轻，且诱导了较强的体液免疫和细胞免疫应答，表明ORF3突变能显著降低PCV-2的毒力，且突变病毒能诱导更强的免疫应答，是PCV-2疫苗研究的一个新方向。He等[14]通过构建缺失ORF4的感染性克隆并体外拯救出缺失ORF4基因的PCV-2病毒，将其感染小鼠后，发现其与野生型病毒相比较，缺失ORF4 的PCV-2病毒比野生型PCV-2具有更强的致病性，揭示ORF4基因是PCV-2致病的负调控基因。Henmann等[15]为了验证嵌合PCV1-2弱毒疫苗和灭活疫苗对母猪的免疫效果，通过动物试验，发现弱毒疫苗和灭活疫苗均能够很好的保护母猪防止PCV-2的感染。

国内韩凌霞等[16]将PCV-2单拷贝基因组插入到pMD18-T中，将获得的pMD-PCV-2感染性克隆质粒免疫40日龄仔猪，发现其能够在体内产生与PCV-2自然感染的大体病变和病理组织学变化，并能够激发机体较强的体液免疫应答。杨顺利等[17]以pcDNA3.1（＋）真核表达质粒为载体也构建了PCV-2的单拷贝和双拷贝感染性克隆，并将其免疫小鼠后，对免疫后不同天数小鼠的血清用ELISA检测，结果免疫后35 d病毒几乎都能检测到衣壳蛋白特异性抗体，小鼠致死后在其体内也能检测到病毒DNA，表明无论是PCV-2单拷贝还是双拷贝感染性克隆质粒均具有感染性。同时我们也采用pcDNA3.1（＋）真核表达载体为骨架也构建了PCV-2的感染性克隆，并人为引入了一个分子标记，将其免疫小鼠后，免疫6周后致死在其体内仍能检测到引入的分子标记，与国内刘长明[18]和Huang[19]等研究结果相一致，表明分子靶标能够稳定遗传，为构建携带遗传标记的PCV-2感染性克隆疫苗奠定前期基础。

3　展望

随着PCV-2全病毒灭活疫苗、PCV1-2嵌合病毒疫苗以及PCV-2亚单位疫苗注册上市，这些疫苗在一定程度上可以有效防控PCV-2感染，能显著降低PCV-2感染猪群的临床症状，提高猪的生长性能，然而这些疫苗免疫并不能完全阻断PCV-2传播，亦不能完全清除体内已感染的病毒，此外这些疫苗诱导的免疫应答主要为体液免疫，忽视了细胞免疫在PCV-2保护免疫中的作用[6]。因此，寻找成本低、能充分诱导体液免疫和细胞免疫的弱毒疫苗和活载体疫苗成为研究热点，核酸疫苗也被广泛的关注。

PCV-2感染性克隆疫苗作为一种新型基因工程疫苗，虽然已有了许多研究，但要想在此领域有重大突破，还有大量的工作要做。同时虽然感染性克隆疫苗具有许多优点，但也要注意到，PCV-2感染性克隆疫苗在其体内拯救的病毒有可能发生毒力返强，即原来缺失的基因，在病毒的连续增殖后，有可能重新获得；采用定点突变技术得到的弱毒疫苗也不排除具有回复突变的可能性；感染性克隆疫苗毒株在自然选择压力下有可能与流行毒株发生基因组交换或重组。这些问题如果能够得以解决，PCV-2感染性克隆疫苗的问世也就为期不远，猪圆环病毒病也将得以更好的控制。此外，感染性克隆疫苗已在黄热病毒和马脑炎病毒有类似的研究报道[20-21]，且均取得了较好的免疫效果，因此，有理由相信感染性克隆疫苗在PCV-2的免疫预防方面，也将具有广阔的应用和开发前景。

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通讯作者：曾智勇，E-mail：as.zyzeng@gzu.edu.cn

作者简介：王伟丞（1990-），男，硕士，研究方向为动物传染病病原分子生物学，E-mail：weichengwangvet@126.com

基金项目：贵州省农业科学攻关项目[黔科合LH字（2014）7670]；国家自然科学基金项目（31560688）

收稿日期：2014-10-28

中图分类号：S852.65+1

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2016）01- 0084- 03