王璐瑶，肖　进，，巴利民，向王震，李　静，齐　鹏（.中国农业大学动物医学院，北京海淀0093；.中牧实业股份有限公司研究院，北京海淀00070）



口蹄疫疫苗细胞免疫评价方法

王璐瑶1，肖进1，2，巴利民2，向王震1，李静1，齐鹏2
（1.中国农业大学动物医学院，北京海淀100193；2.中牧实业股份有限公司研究院，北京海淀100070）

肖进（1978-），男，工程师，博士生，主要从事合成肽疫苗及诊断试剂研发工作，E-mail：xjpeptide@126.com

注：肖进与王璐瑶对本文具有同等贡献

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。该病因宿主范围广、传染性强、传播迅速，严重危害发病地区的畜牧业发展，造成巨大的经济损失。目前，口蹄疫已经被世界动物卫生组织（OIE）列为A类传染病，发病地区和国家的畜产品进出口贸易将受到严重限制。口蹄疫病毒分为A、O、C、Asia、SAT1、SAT2、SAT3七个血清型。各个血清型之间缺乏交叉保护性，不同血清型的亚型和分离株间的抗原变异很大，给口蹄疫的防疫工作增加了难度。目前口蹄疫的防治以免疫接种为主，我国目前采用的疫苗主要为灭活苗和合成肽疫苗，农业部已将口蹄疫列为我国强制免疫的传染病之一。

1　我国口蹄疫疫苗的使用情况

目前我国应用最多的口蹄疫疫苗为全病毒灭活苗。如牛口蹄疫O型灭活疫苗，选择抗原谱广，抗原性和免疫原性较好的牛源强毒为毒种，接种于BHK-21传代细胞系，单层培养，制备抗原。采用二乙烯亚胺灭活，加矿物油佐剂制成。合成肽疫苗、基因工程疫苗以及DNA疫苗等新型疫苗的出现，给口蹄疫的防控和净化等工作带来契机。与传统灭活苗相比较，新型疫苗有着安全性高、免疫效果好、制备工艺简单等突出优点，将成为今后防控口蹄疫的主要产品。

2　口蹄疫的细胞免疫

一般认为，动物机体针对口蹄疫病毒的抗感染免疫主要依靠高水平的抗体，但细胞免疫在口蹄疫的免疫应答过程中同样具有重要作用[1]。参与口蹄疫细胞免疫的细胞主要有单核细胞和巨噬细胞，致敏T淋巴细胞及其释放的淋巴因子。单核细胞和巨噬细胞是机体固有免疫主要的效应细胞，可杀伤吞噬溶解被病毒感染的靶细胞，在感染早期，控制病毒载量，致敏T淋巴细胞是细胞免疫主要的效应细胞，主要包括辅助性T细胞（Th）和细胞毒性T细胞（CTL）。Th1和Th2可辅助B细胞产生抗体。CTL能特异性地识别病毒和感染细胞表面的病毒抗原，杀死病毒或靶细胞。相关研究显示，在口蹄疫病毒重组痘苗免疫动物的脾细胞中检测到口蹄疫病毒的特异性CTL反应，但细胞活性较低，可能的原因是口蹄疫病毒感染的细胞膜上MHC-肽复合物的表达水平较低，导致口蹄疫病毒的T细胞表位无法被有效递呈。口蹄疫病毒感染细胞后，会抑制其MHCI类分子的表达，从而抑制MHCI将病毒肽递呈给CD8＋T细胞，减弱CTL作用。在牛体免疫试验中发现，口蹄疫病毒的T细胞表位在各血清型之间具有交叉性，T细胞免疫的优势位点在VP1蛋白的21～40氨基酸序列上。有关于口蹄疫合成肽疫苗的研究显示[2]，合成肽疫苗的低免疫原性与Th细胞表位的缺乏有关，通过增加额外的Th细胞表位可以克服口蹄疫病毒MHC限制性。Rodrguez A[3]等通过采用合成的VP1、VP2、VP3和VP4蛋白刺激猪的外周血单个核细胞，证实VP1蛋白第141～209位氨基酸残基存在口蹄疫病毒的Th细胞位点，可以克服MHC的遗传限制。

3　口蹄疫疫苗免疫后细胞免疫的评价方法

由于T细胞免疫的过程比较复杂，参与反应的细胞和细胞因子较多，全面客观地评估细胞免疫有一定难度。评价T细胞免疫，一般以某一抗原特异性的T细胞数量或功能性细胞因子的反应水平作为主要的评价指标。但是采用单一指标评价T细胞免疫水平并不能完全地反应T细胞免疫的状态和特征。效应性T细胞的增殖能力，杀伤活性等对于全面的评价T细胞免疫同样重要。3.1迟发型超敏反应（delayed type hypersensitivity，DTH）迟发型超敏反应也称Ⅳ型超敏反应，DTH是由抗原特异性细胞介导的，发生反应较迟，进程较为缓慢。DTH首先由CD4＋Th细胞启动，之后由CD8＋T细胞介导造成组织损伤。将抗原皮下注射到动物体内，就可观察到红斑、硬块的发生和大小。利用这种特性，可以在动物体内进行T细胞功能的监测。

此方法能够反应T细胞在复杂的整体状态下的反应，操作简单，较为直观。但是由于易产生假阳性和假阴性，故只能作为初步的鉴定。

3.2酶联免疫斑点法（ELISPOT）酶联免疫斑点法是一种在体外单细胞水平检测特异性抗体和细胞因子分泌细胞。IFN-γ在清除体内的细菌、病毒、真菌等的感染过程中发挥重要作用，因此IFN-γ分泌和产生是评价T细胞免疫最常用的功能性指标。但是也有证据表明，单一地用IFN-γ的分泌来评价T细胞免疫是不够全面的。除IFN-γ外，TNF-α和IL-2在T细胞免疫过程中同样发挥重要作用。综合这3个细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-2，能够相对比较全面的评价某一病原的T细胞免疫反应。Gerner W[4]等，在研究口蹄疫病毒3D非结构蛋白上一个新发现的特异性T细胞表位时，采用ELISPOT的方法检测了人工感染口蹄疫病毒后的两个纯种小型猪淋巴细胞中IFN-γ的分泌情况。

3.3淋巴细胞转化试验T淋巴细胞与有丝分裂原在体外共同培养时，由于T细胞表面具有有丝分裂原受体和抗原受体，当受到有丝分裂原的刺激时会发生形态学和生物学的变化，如细胞体积增大、代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加，即向淋巴母细胞进行增殖。这种现象称为淋巴细胞转化现象。淋巴细胞转化试验的具体的结果用淋巴细胞转化率和脉冲指数或刺激指数来表示。

用于检测细胞增殖能力的方法主要有两种。一种是直接测定进行分裂的细胞数来评价的增殖能力。另一种是通过检测细胞活性来评价细胞的增殖能力，即测定样品中健康细胞的数目。

经典方法是胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）渗入法，但缺点是具有放射性，不利于安全操作。在口蹄疫疫苗的评价工作中常用评价T淋巴细胞增殖能力的方法有MTT法、MTS法、XTT法以及WST-8法等。试验结果一般以刺激指数（SI）来表示，计算方法为实验组的光吸收值比上阴性对照组的光吸收值。齐鹏等[5]利用MTT法评价了含有E、F两种多肽抗原（含有口蹄疫病毒VP1蛋白上主要B细胞抗原表位140～160及VP4上40～60 T细胞抗原表位）的口蹄疫合成肽疫苗的细胞免疫应答。刘新生[6]利用WST法测定了用重组VP1蛋白免疫后的小鼠淋巴细胞的增殖能力。

3.4细胞内因子染色试验细胞内因子染色试验是将流式细胞术和细胞内细胞因子染色技术相结合的一种有效的在单细胞水平研究细胞因子的方法。1997年，Waldrop等首次建立。其基本原理是利用细胞因子跨膜分泌阻断剂BFA，使新产生的细胞因子滞留在细胞内。再用破膜剂使荧光抗体进入细胞内，检测到相应的细胞因子。之后利用流式细胞术计数细胞，进行分析。细胞内因子染色试验的优点是可以准确地分析特定的CD4＋T细胞亚群和CD8＋T细胞亚群的抗原特异性应答。可以在一个抗原特异性T细胞中综合分析多种细胞因子的分泌情况。

王潇[7]等利用能对活细胞进行染色的CFSE检测了鼻腔接种口蹄疫DNA疫苗（pcD-VP1）和真核表达质粒（proVAX-IL-10）的小鼠扁桃体淋巴细胞增殖反应水平，接着用胞内因子染色法通过流式细胞仪检测扁桃体部位CD4＋T细胞内IFN-γ 和IL-4的表达量。Joshi G[8]等用O型，A型以及Asia1型口蹄疫病毒感染牛外周血单个核细胞来研究，并采用流式细胞术对T细胞亚型进行分析，发现口蹄疫病毒体外感染外周血单个核细胞能够造成短时间的CD4＋T细胞和CD8＋T细胞免疫的抑制。

3.5细胞毒性T细胞（CTL）杀伤活性检测细胞毒性T细胞，属CD8＋T细胞，能特异性的杀伤被病毒感染的靶细胞，在细胞免疫的过程中起着极为重要作用。因此可以通过检测CTL对于靶细胞的杀伤活性来评价细胞免疫。

检测CTL杀伤活性的方法主要有51Cr释放法，乳酸脱氢酶（LDH）释放法，以及荧光测定法。51Cr释放法是测定CTL细胞毒活性最经典的方法。51Cr释放法结果准确，重复性好，但由于51Cr具有放射性，不利于安全操作，因而应用受到限制。LDH释放法的原理是细胞质中富含LDH，在正常情况下是不能通过细胞膜的，但当细胞死亡或者受损时，便会有LDH被释放出来，可以认为细胞的死亡数目与细胞培养上清中的LDH活性成正比，通过比色法测定LDH的活性即可计算CTL的杀伤百分率。与51Cr释放法相比，其优点是无放射性，操作安全，但是准确性不高。此外，近年来又出现了荧光标记、流式细胞分析和报告基因等灵敏度高，操作简单的测定方法。

郑敏等[9]用口蹄疫重组鸡痘疫苗免疫猪，两次免疫后，采血并分离外周血单个核细胞，利用乳酸脱氢法检测了T细胞的杀伤活性。金宁一等[10]用vUTAL3CP1重组载体疫苗和pVIRIL18P1 DNA疫苗在40日龄和68日龄对猪进行两次免疫接种，之后采用乳酸脱氢酶法测定特异性CTL的杀伤活性。

细胞毒的检测技术还包括补体依赖的细胞毒试验，NK细胞介导的细胞毒试验等。NK细胞是在天然免疫系统中发挥主要作用的效应细胞，可直接杀伤病毒感染的靶细胞和某些肿瘤细胞，主要在宿主感染胞内病原体的早期阶段发挥防御功能。

3.6mRNA定量法mRNA是在mRNA水平检测受刺激的淋巴细胞中细胞因子的水平，其定量的方法是RT-PCR。基本的操作过程包括RNA的提取，mRNA逆转录为cDNA，PCR扩增DNA产物，产物的定量检测等。最为常见的定量方法有内参照定量PCR，竞争性定量PCR以及实时荧光定量PCR法。

内参照定量PCR的基本原理是将模板和已定量的非竞争性内参分别同时进行PCR扩增。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。得到的PCR产物可用电泳和高效液相进行分离，分别测定其荧光强度，以内标作为对照定量待检测模板。竞争性定量PCR则是通过一个有突变克隆产生的含有新的限制性酶切位点的竞争性模板来定量待检测模板。可以通过酶切等方法将已定量的竞争性模板与待测模板分离开来。

但是由于这类定量PCR的方法采取的都是终点检测，即通过PCR达到平台期时的终点产物量来推算出其实模板的量，检测重复性极差，即使加入内参可以在一定程度上消除这种不确定性，仍然难以准确的定量起始模板的量，因而这类方法只能做粗略的半定量。

实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR，RT-qPCR）则是每一轮循环均检测1次荧光强度，由于起始模板的对数与Ct值（荧光阈值，即扩增DNA的荧光强度达到阈值的循环次数）呈线性关系，所以可以通过对每个样品Ct值的计算，再对照标准曲线获得测量结果，不需要内参。同时由于达到Ct值时，PCR反应仍处于对数期，误差尚未放大，Ct值的重现性极好，解决了上述终点检测所造成的不确定性问题。实时荧光定量PCR作为一种新技术，已经开始被广泛应用于细胞因子的检测中。

Su B[11]等从免疫48 h后的巨噬细胞中提取了总RNA，并采用RT-qPCR的方法检测了细胞因子IFN-α，IL-6，TNF-α，TGFβ，IL-10以及CD86的表达量。Gowane G R[12]等通过RT-qPCR的方法，研究了接种口蹄疫三价灭活疫苗后的牛体内IL-6 和IL-21的表达情况，同时采用液相阻断ELISA检测了抗体水平。结果发现，免疫后的牛体内IL-6和IL-21的表达量明显高于未免疫组。

3.7MHC四聚体技术MHC四聚体技术是由Altman J D等[13]首先提出的，即将MHC分子，抗原肽，荧光染料标记联接蛋白组成的单体物，通过亲和素铰链的四聚体复合物来检测HIV特异性的CTL细胞。MHC四聚体技术的基本原理是将MHC单体分子四聚体化，以提高MHC-肽复合物与T细胞受体（TCR）之间的亲和力，使之可以与T细胞上的多个TCR相结合，这种技术可以直接特异性地检测T细胞。根据MHC分子的不同，四聚体技术又可以分为与MHCⅠ结合的四聚体技术和与MHCⅡ结合的四聚体技术，用以研究CD4＋T细胞和CD8＋T细胞。Jared R. Patch[14]等采用MHC四聚体染色技术验证了用含有T细胞表位的口蹄疫病毒的衣壳蛋白的降解物免疫猪，并与灭活苗相比较，衣壳蛋白的降解物能够诱导机体产生针对口蹄疫病毒的特异性的CTL反应。

4　小结

以上针对口蹄疫疫苗免疫产生的细胞免疫评价方法各有其优缺点，而目前尚缺乏一个较为完善的口蹄疫疫苗评估方案。相信随着我国畜牧兽医事业的不断发展和规范，今后的口蹄疫疫苗评价工作，以及口蹄疫的防控工作将会更加合理规范。

参考文献：

[1]杜进鑫，王永录.口蹄疫细胞免疫研究进展[J].生物技术通报，2009，5：5.

[2] Francis M J，Hastings G Z，Syred A D，et al.Non-responsiveness to a foot-and-mouth disease [J].virus peptide overcome by addition of foreign helper T-cell determinants，1987.

[3] Rodriguez A，Sáiz J C，Novella I S，et al.Antigenic specificity of porcine T cell response against foot- and- mouth disease virus structural proteins：identification of T helper epitopes in VP1[J] . Virology，1994，205（1）：24-33.

[4] Gerner W，Carr B V，Wiesmuller K H，et al.Identification of novel foot-and-mouth disease virus specific T-cell epitopes in c/c and d/d haplotype miniature swine[J].Virus Res，2006.121（2）：223-228.

[5]齐鹏，肖进，王楠，等.MTT法评价猪口蹄疫合成肽疫苗的细胞免疫应答[J].中国兽药杂志，2011，45（2）：13-15.

[6]刘新生.口蹄疫病毒AF/72株结构蛋白VP1的H-2d限制性T细胞表位筛选与鉴定[D].北京：中国农业科学院，2011.

[7]王潇，王志钢，杜瑞平.白细胞介素-10分子佐剂增强口蹄疫DNA疫苗黏膜免疫效果研究[J].中国农业科学，2011，14：3045-3052.

[8] Joshi G，Sharma R，Kakker N K，et al.Phenotypic and functional characterization of T-cells and in vitro replication of FMDV serotypes in bovine lymphocytes[J].Vaccine，2009.27（48）：6656-6661.

[9]郑敏，金宁一，秦晓冰，等.口蹄疫重组鸡痘病毒诱导猪特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤活性检测[J].中国生物工程杂志，2005，05：50-54.

[10]金宁一，郑敏，秦晓冰，等. vUTAL3CP1重组载体疫苗与pVIRIL18P1 DNA疫苗在猪体内的免疫原性研究[J].免疫学杂志，2006，03：260-264

[11] Su B，Wang J P，Zhao G，et al.Sequential administration of cytokine genes to enhance cellular immune responses and CD4（＋）T memory cells during DNA vaccination[J].Hum Vaccin Immunother，2012.8（11）：1659-1667.

[12] Gowane G R，Sharma A K，Sankar M，et al.The Expression of IL6 and 21 in Crossbred Calves Upregulated by Inactivated Trivalent FMD Vaccine[J].Animal biotechnology，2014，25（2）：108-118.

[13] Altman J D，Moss P A H，Goulder P J R，et al.Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes[J].Science，1996，274（5284）：94-96.

[14] Patch J R，Pedersen L E，Toka F N，et al.Induction of foot-andmouth disease virus-specific cytotoxic T cell killing by vaccination[J].Clinical and vaccine immunology，2011，18（2）：280-288.

通讯作者：齐鹏，E-mail：cahic_ivd@vip.tom.com

作者简介：王璐瑶（1991-），男，硕士，研究方向为预防兽医学，E-mail：wangluyao2712@163.com

收稿日期：2014-10-20

中图分类号：S852.65

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2016）01- 0081- 03