黄炬辉

・实验研究・

苦瓜子有效成分RNA酶MC2抑制肝癌细胞生长的作用分析

黄炬辉

目的 对苦瓜子有效成分RNA酶(RNase)MC2抑制肝癌细胞生长的作用和机制进行分析和探讨。方法 通过克隆形成和MTT对肝癌细胞增殖受到的RNase MC2的影响进行分析；选择流式细胞技术对肝癌细胞周期受到的RNase MC2的影响进行检测；选择电镜对细胞自噬受到的RNase MC2的诱导作用进行检测。结果 RNase MC2会对肝癌细胞增殖起到显著的抑制作用；通过对p21和p53蛋白表达进行上调能够导致G2/M期阻滞；通过LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达的增加能够对细胞自噬起到诱导作用。结论 RNase MC2通过对p21的上调能够对G2/ M 期阻滞起到诱导作用,通过对Beclin-1的上调能够对细胞自噬起到诱导作用,从而对肝癌细胞中的增殖起到显著的抑制作用。

RNA酶MC2；肝癌细胞；抑制

在全球范围内肝癌细胞都属于一种常见的恶性细胞,因此肝癌细胞治疗技术的进展受到了人们的普遍关注。肝癌细胞的抗药性非常强,其具有很高的死亡率。现阶段肝癌细胞的治疗技术仍然没有实现突破性进展,大量的研究表明［1］,治疗肝癌细胞的一个非常重要的途径就是提取中草药中的有效成分,对其中的抗肿瘤药物进行筛选。作为一种核糖核酸酶,RNase C2属于一种饮食苦瓜子提取物,其能够对肝癌细胞的生长起到抑制作用。本文对苦瓜子有效成分RNase MC2抑制肝癌细胞生长的作用和机制进行了分析和探讨,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 从美国模式培养物集存库(ATCC)购买el-7402和QGY-7703人类肝癌细胞株,由本院提供RNase MC2,通过纯水溶解RNase MC2,使其成为5.0mmol/L储存液的形式。

1.2 方法 ①细胞培养：在CO2培养箱中培养el-7402(为对照)和QGY-7703人类肝癌细胞株,具体培养条件为：选

择10%胎牛血清的DMEM作为培养基；温度为37℃；湿度为95%；CO2浓度为5%［2］。②通过MTT法测定细胞活性。在96孔板中对8000个细胞进行24 h的培养,随后将浓度分别为20、5、1 μmol/L的RNase MC2加入进去,进行48 h的孵育。将100ml的MTT溶液分别加入到每孔中,使其持续2.5 h的作用［3］。在将上清液去除掉后,将100ml的二甲亚砜(DMSO)溶液加入,利用分光光度计对充分溶解后的晶体进行读取。③克隆形成实验：在6孔板中对100个细胞进行培养,随后在5.0 μmol/L RNase MC2的培养基中将其加入。选择0.05%结晶紫对其进行5min的染色,对集落数量进行计算［4］。④细胞周期检测：在细胞受RNase MC2作用不同时间后,通过70%的乙醇将其固定在4℃冰箱中过夜,将磷酸盐缓冲溶液(PBS)加入,在黑暗中对其进行30min的放置。通过流式细胞仪对不同细胞周期的细胞数量进行检测［5］。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用t检验；计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 RNase MC2对肝癌细胞增殖的抑制作用 浓度在2.5 μmol/L以上的RNase MC2能够使肝癌细胞活性为60%以下,对肝癌细胞的活性起到显著的抑制作用,2.5 μmol/L以下的RNase MC则具有抑制80%以上的肝癌细胞活性, 比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。克隆形成结果显示,RNase MC2能够使肝癌细胞的克隆形成能力出现明显下降。

2.2 RNase MC2对G2/M期阻滞的诱导作用 通过流式细胞技术检测结果显示,肝癌细胞在受到RNase MC2作用的24 h之后,其出现了G2/M期阻滞。如其中的2.5 μmol/L,Bel-7402在G2/M期达到了(36.95±5.26)%的细胞百分比,QGY-7703在G2/M期达到了(30.25±3.72)%的细胞百分比；对照细胞则分别达到了(23.50±3.63)%和(17.74±4.62)%的细胞数量百分比,比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 RNase MC2对肝癌细胞自噬的诱导作用 通过四甲吖啶进行染色,对RNase MC2产生的对细胞质内酸性自噬泡的诱导作用进行进一步观察。结果显示,肝癌细胞在经过RNase MC2处理后出现了明显增多的细胞质内酸性自噬泡数量。电镜结果显示,肝癌细胞在经过RNase MC2处理后形成了多个自噬小体。此外,上调的LC3-Ⅱ和Beclin-1表达对发生细胞自噬具有提示作用。

3 讨论

通过中药能够使化疗药物的副作用得以有效减轻,使肿瘤患者的生活质量得以改善,并且增加肿瘤患者的生存期。所以提取中药中的有效成分,使其对肝癌细胞进行对抗,是突破肝癌细胞治疗瓶颈的一种非常重要的方式［6］。本次研究发现,RNase MC2作为苦瓜子的有效提取成分,可以对肝癌细胞的增殖起到显著地抑制作用,RNase MC2通过对p21的上调能够对G2/ M期阻滞起到诱导作用,通过对Beclin-1的上调能够对细胞自噬起到诱导作用,其主要是对肝癌细胞中的Bel-7402和QGY-7703的表达进行诱导,从而进一步诱发出现G2/ M 期阻滞。

在病理状态细胞和正常细胞中自噬属于一种普遍存在的生理机制,在细胞的生理和病理过程中自噬具有十分重要的作用,特别是在癌细胞中作为细胞代谢压力的适应性反应自噬发挥了十分重要的作用［7］。本次研究表现,RNase MC2通过对Beclin-1的上调能够对细胞自噬起到诱导作用。但是目前尚未清楚在RNase MC2诱发细胞死亡中自噬的作用机制,仍然需要对其作用机制进行更深一步的研究［8］。

综上所述,本次研究显示RNase MC2通过对p21的上调能够对G2/ M 期阻滞起到诱导作用,通过对Beclin-1的上调能够对细胞自噬起到诱导作用,从而对肝癌细胞中的增殖起到显著地抑制作用。因此表明,RNase MC2作为苦瓜子的有效提取成分,属于一种具有开发价值的抗肿瘤药物。

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10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.11.203

2016-03-09］

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