胡　莹，邰文琳，马　润，王　卓，番寿蕊，王玉明



昆明地区碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌耐药性分析及基因型检测

胡莹1，邰文琳2，马润1，王卓1，番寿蕊1，王玉明1

摘要：目的研究昆明地区临床分离碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌(CRE)耐药性及基因型。方法收集2009年1月至2012年12月昆明地区三甲医院分离的77株CRE；采用改良Hodge试验表型检测碳青霉烯酶、EDTA双纸片协同试验筛选金属酶； PCR检测blaNDM-1、blaKPC、blaIMP、blaVIM基因，对PCR产物纯化、DNA测序。结果77株CRE以肺炎克雷伯菌为主，占75.32%(57/77)；本组CRE均为多重耐药株；55株CRE改良Hodge试验阳性，双纸片协同试验阳性15株；PCR扩增KPC基因阳性45株，NDM基因阳性9株，IMP基因阳性5株，18株未扩增出特异性条带；IMP株为IMP-4亚型，KPC株为KPC-2亚型。结论KPC-2和NDM-1型碳青霉烯酶为昆明地区肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶的主要型别，在临床开展对CRE细菌产碳青霉烯酶型别的监测十分重要。在18株CRE中并未检出目的基因，其耐药机制有待于进一步的研究。

关键词：肠杆菌科细菌；碳青霉烯酶；耐药性；基因型

作者单位：1.昆明医科大学第二附属医院检验科，云南昆明 650101

2.云南省分子诊断中心，云南昆明 650101

肠杆菌科细菌是引起院内感染和社区获得性感染的最常见的临床致病菌之一，而对碳青霉烯类抗生素耐药肠杆菌科细菌(carbapenem-resistant enterobacteriaceae,CRE)的出现，使得对于此类细菌引起的感染的临床治疗陷入无药可用的境地。本文旨在对昆明地区肠杆菌科细菌中碳青霉烯类耐药菌株检测其耐药性及基因型，为本地区泛耐药(pandrug-resistant bacteria,PDR)肠杆菌科细菌的分子流行病学研究和医院感染控制提供基础资料。

1材料与方法

1.1菌株来源从2008年1月至2012年12月共收集102株碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌，主要来自昆明地区3家三甲医院，包括昆明医科大学第二附属医院93株、云南省人民医院3株、昆明市延安医院6株、所有细菌采用Vitek2细菌全自动鉴定仪鉴定。

1.2主要试剂与仪器药敏纸片：12种抗菌药物药敏纸片均购自法国梅里埃公司，包括亚胺培南(imipenem，IPM)、美洛培南(meropenem，MEM)、厄他培南(ertapenem，ETP)、哌拉西林/他唑巴坦(piperacillin/tazobactam，TZP)、头孢他啶(ceftazi-dime，CAZ)、头孢哌酮/舒巴坦(cefoperazone/sulbactam，CPS)、头孢吡肟(cefepime，FEP)、头孢噻肟(cefoxitin，CTX)、环丙沙星(ciprofloxacin，CIP)、阿米卡星(amikacin，AMK)、氨曲南(aztreonam，ATM)、复方磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole and trimethoprim，SXT)、四环素(tigecycline，TGC)；左氧氟沙星 (levofloxacin，LVF)药敏纸片购于Oxoid公司。Vitek-2 compact细菌全自动鉴定仪为法国生物梅里埃公司产品；PCR扩增仪由PE公司生产。

1.3方法

1.3.1药敏试验严格按照CLSI2008-2013年版推荐的K-B测定抗菌药物的17种抗菌药物的测定。

1.3.2耐药表型检测改良Hodge试验依据CLSI(2009年)试验方法及判定标准，EDTA协同试验参考Lee等 试验方法及判定标准。

1.3.3耐药基因检测DNA的提取：煮沸法提取菌株总DNA。PCR扩增目的基因：根据GenBank数据库收录的序列，引物设计参考文献[2-3](见表1)，扩增碳青霉烯酶基因片段，包括KPC酶，金属酶IMP、NDM-I、VIM型碳青霉烯酶，引物序列由上海生工生物工程公司合成，具体见表1。

表1　引物序列和产物大小

1.3.4DNA测序分析PCR反应产物委托杭州博尚生物技术有限公司纯化、双向测通并拼接，将得到的拼接序列与GenBank中Blast进行同源性分析，确定其基因型别。

2结果

2.1菌株分布检出的77 株碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌中，肺炎克雷伯菌57株(75.32%)，弗劳地枸橼酸杆菌8株(10.39%)，大肠埃希菌7株(9.09%)，产酸克雷伯菌2株(2.60%)，阴沟肠杆菌2株(2.60%)，产气肠杆菌1株(1.30%)。

2.2药敏试验本组受试的77株CRE均为多重耐药株，其中对头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟、氨曲南以及厄他培南的耐药率为100%；对两种酶抑制剂复方制剂(头孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他巴唑坦)的耐药率均为95%左右；对阿米卡星和环丙沙星的耐药率分别为85.3%和97.1%。对四环素和复方磺胺甲恶唑耐药率较低，分别为25.6%和27.9%。

2.3碳青霉烯酶表型筛选和双纸片协同试验77株CRE中55株改良Hodge试验阳性，其中包括53株肺炎克雷伯菌，1 株阴沟肠杆菌，1株产酸克雷伯菌。双纸片协同试验阳性15株。

2.4碳青霉烯酶基因的PCR与测序77株肠杆菌科细菌中KPC基因阳性45株，见图1。NDM基因阳性9株，见图2。IMP基因阳性5株，见图3。18株未扩增出特异性条带。IMP型为IMP-4亚型，KPC株为KPC-2亚型。

图1　部分KPC基因PCR产物电泳图

图2　部分NDM基因PCR产物电泳图

图3　部分IPM基因PCR产物电泳图

3讨论

近年来由于碳青霉烯类抗菌药物临床用量的不断增长，革兰阴性杆菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药率亦逐年上升。我国首次报道了产KPC酶肺炎克雷伯菌[6-8]，随后在多个地区报道了产KPC酶肠杆菌科细菌的暴发流行[7-8]。本研究药敏结果显示，昆明地区CRE菌株除了对复方磺胺甲恶唑、四环素、阿米卡星等药物有较高的敏感率之外，对其余临床常用抗生素均表现为耐药。近年来国内外对泛耐药的耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌也常有报道，提示在此类泛耐药菌株的临床治疗过程中，将以往的经验性用药变为依据药敏试验结果的目的性用药，以保证较好的抗菌疗效。

在医院的高危患者中出现耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌并快速的国际传播中[10]，抗菌药物耐药基因的水平播散是重要原因。本实验对常见产酶基因型进行PCR检测，结果显示部分CRE携带blaKPC、blaNDM、blaIM基因。发现KPC-2和NDM-1型碳青霉烯酶为昆明地区肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶的主要型别。18株未扩增出任何目的条带的耐药菌株，可能为膜孔蛋白表达下调，为本实验未探讨的其他耐药机制引起。

碳青霉烯酶类抗生素目前是治疗肠杆菌科细菌感染最有效的药物，本次检测昆明地区出现了KPC-2和NDM-1菌株，应引起临床医师的高度重视，临床微生物实验室应特别重视金属酶及其他碳青霉烯酶的检测，对控制耐药菌株传播和指导临床合理用药具有重要意义。

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·基础医学·

Drug Resistance and Genotype Analysis of Carbapenem-resistant

Enterobacteriaceae

HU Ying,TAI Wen-lin,MA Run,et al

(Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University,Kunming 650101,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the drug resistance and genotype of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae (CRE) in Kunming.Methods77 CRE isolates were collected from January 2009 to December 2012.Their carbapenemase phenotypes were detected by modified Hodge test and screened metallo-B-lactamase positive strains by EDTA disc synergy test. The blaNDM-1,blaKPC,blaIMP and blaVIM genes of carbapenemase were detected by PCR, then the obtained PCR products were performed DNA sequencing.Results75.32 percentage of CRE isolates were identified to be Klebsiella pneumoniae, and most of CRE are multi-drug resistant bacteria. The positive results of CRE isolates in the modified Hodge test and EDTA disc synergy test were 55 and 15 isolates respectively. The blaKPC gene was identified from 45 isolates by PCR, 9 blaNDM isolates and 4 blaIMP gene isolates were detected．IMP-4 and KPC-2 isolates was identified by DNA sequencing. The target gene of 18 CRE isolates were not detected.ConclusionThe KPC-2 and NDM-1 were the major genotypes of carbapenemase in Kunming hospital. It was important that drug resistance surveillance of CRE isolates. Target gene of 18 isolates were not detected, so their drug resistance mechanism should be further experimental study.

Key words:enterobacteriaceae；carbapenemase；drug resistance；genotype

通信作者：王玉明，男，主任医师，E-mail：wangym992011@163.com

作者简介：胡莹(1977-)，女，江西南昌人，主治医师，从事临床微生物与分子生物检验工作。

收稿日期：2015-10-17

基金项目：云南省应用基础研究面上项目(2013FB153)

中图分类号：R378.2+1,R446.5

文献标志码：A

文章编号：1672-688X(2015)04-0241-03