补中益气丸对糖尿病大鼠胃黏膜诱导型一氧化氮合酶及环氧化酶2表达的影响

王宁丁1，刘晓秋2，伍军军1，陈嘉1，周钱粮1，陈英杰3，张永斌1*

(1.广州中医药大学实验动物中心，广州 510405；2.广州中医药大学脾胃研究所，广州 510405；

3.广州中医药大学第一临床医学院，广州 510405)

摘要：目的观察补中益气丸对糖尿病大鼠胃黏膜诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧化酶2(COX-2)表达的影响，分析补中益气丸胃黏膜保护的作用机制。方法腹腔注射链脲佐菌素(STZ)结合30%乙醇灌胃建立糖尿病大鼠胃黏膜损伤模型,第5周起开始给药连续12周，观察大鼠体重及血糖变化，采用RT-PCR法和western-blot检测胃组织COX-2、iNOS的表达。结果大鼠持续消瘦且血糖居高不下,糖尿病成模率为75%。模型组COX-2mRNA、iNOSmRNA和中药组iNOSmRNA值均大于正常组(P<0.01),而中药组COX-2mRNA值小于模型组(P<0.05)。Western blot结果显示，模型组COX-2蛋白表达量大于正常组(P<0.05)，中药组COX-2与正常组差异不显著(P>0.05)，模型组和中药组iNOS均大于正常组(P<0.05)。结论糖尿病大鼠胃黏膜损伤严重,补中益气丸能调节COX-2和iNOS的表达，阻止胃黏膜损伤和糖尿病的进一步发展。

关键词：糖尿病;大鼠;胃黏膜;一氧化氮合酶;环氧化酶;补中益气丸

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.03.020

中图分类号：R587.1文献标志码： A

文章编号：1003-5699(2015)03-0279-04

基金项目:广东省科技计划资助项目(2010B060500013,2011B060300007)；国家级大学生创新创业训练计划项目(201310572021)。

作者简介:王宁丁(1990-)，女，硕士研究生，主要从事人类疾病模型建立及药效研究。

收稿日期:(责任编辑：张瑞彬2014-08-18)

*通信作者:张永斌，电话-(020)39358528，电子信箱-zyb-73@163.com

Effects of Buzhong yiqi pills on expression of iNOS and COX-2 in gastric tissue of diabetic rats

WANG Ningding1,LIU Xiaoqiu2,WU Junjun1,CHEN Jia1,ZHOU Qianliang1,CHEN Yingjie3,ZHANG Yongbin1*

(1.Laboratory Animal Research Center,Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine,Guangzhou 510405,China;

2.Spleen and Stomach Institute,Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine,Guangzhou 510405,China;

3.First Clinical Medical College,Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine,Guangzhou 510405,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effects of Buzhong yiqi pills on the expression of iNOS and COX-2 in gastric tissue of diabetic rats,and to analyze the gastric mucosa protection mechanism of Buzhong yiqi pills.MethodsThe diabetic rat gastric mucosa damage model was established by intraperitoneal injection of streptozotocin (STZ) combined with orally administered ethanol.At the fifth week,drugs were given for 12 weeks,and body weight and blood sugar changes of rats were observed and the expressions of iNOS and COX-2 in gastric tissue were detected by RT-PCR and western blot.ResultsRats pine away in succession and their blood sugar was staying at a high level,and the success rate of diabetes model was 75%.Absorbance ratio of COX-2mRNA and iNOSmRNA in model group and TCM group were higher than that in normal group(P<0.01),COX-2mRNA absorbance ratio in TCM group is lower than that of model group (P<0.05).The result of western blot analysis showed that COX-2 protein expression levels in the model group COX-2 were higher than that in the normal group (P<0.05),but COX-2 in TCM group had no significant differences with normal group (P>0.05).iNOS in model group and TCM group were significant higher than that in normal group (P<0.05).ConclusionGastric mucosa of diabetic rats was seriously damaged,buzhong yiqi pills can regulate the expression of iNOS and COX-2,preventing development of gastric mucosal lesion and diabetes.

Keywords:diabetes;rats;gastric mucosa;nitric oxide synthase;cyclooxygenase;Buzhong yiqi pills

胃肠疾病是糖尿病的常见并发症之一，该并发症常影响口服降糖药物及其他药物的疗效，以及食物代谢吸收,进而影响糖尿病的控制。链脲佐菌素(STZ)糖尿病大鼠普遍存在胃、小肠黏膜氧化应激和损伤[1-3],肠黏膜屏障的减弱和肠渗透性的增加将提高患1型糖尿病的风险。NOS和COX均存在结构性(cNOS和COX-1)和诱导型(iNOS和COX-2)[4-5]，NOS和COX在胃肠黏膜各层均有分布[6],通过相互协作和相互介导，催化产生一氧化氮(NO)和前列腺素(PGs),构成胃肠黏膜防御系统，在维持基本的胃黏膜血流、发展对有害刺激的充血反应及在胃黏膜的修复中起关键性作用[7]，但NO和PGs产生过多，将导致胃肠黏膜损伤[8]。补中益气丸是益气健脾的代表方,有诸多研究用补中益气丸来治疗胃溃疡、糖尿病性胃轻瘫、糖尿病性腹泻等病症,均取得了较好的疗效[9-12]，实验将对糖尿病胃黏膜损伤机制及补中益气丸的作用进行探索。

1实验材料

SPF级SD大鼠100只，雄性，体质量180～220 g，购于广州中医药大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK(粤)2008-0020。补中益气丸(九芝堂股份有限公司)，链脲佐菌素(STZ)、氯仿和焦炭酸二乙酯(Sigma公司)，稳毫型血糖试纸(强生上海医疗器材公司)，CDNA试剂盒(Fermentas公司)，Trizol reagent(Invitrogen公司),引物(上海英潍捷基公司)，兔抗鼠COX-2抗体、羊抗兔IgG(武汉博士德公司)，兔抗鼠iNOS抗体(北京博奥森公司)。

2实验方法

2.1动物造模及分组大鼠禁食不禁水12 h后腹腔注射1%STZ溶液(用0.1 mol/L,pH 4.2的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲配制成10 g/L的溶液)，剂量5.5 mL/kg，正常组大鼠腹腔注射0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲液5.5 mL/kg。注射STZ72 h后监测随机血糖，连续3次血糖值≥16.8 mmol/L，且有多饮、多尿，多食症状，入选糖尿病动物模型，造模同时每周大鼠灌胃30%乙醇1次,剂量10 mL/kg，连4周，制成糖尿病胃黏膜损伤模型。4周后，随机分为正常组，模型组，模型+补中益气丸组(中药组)。实验第5周起开始给药，正常组及模型组等体积生理盐水(20 mL/kg·d)灌胃,连续12周，中药组给予补中益气丸灌胃(3.75 g/kg·d)，连续12周。各组大鼠予自由饮食和充足饮水,上、下午各更换垫料1次，定期监测动物体质量及血糖变化。

2.2标本提取及处理实验第16周末,动物空腹过夜，第2天处死动物，剖腹取胃，沿胃大弯剪开并翻转胃腔，漂洗于4 ℃生理盐水，除去胃肠腔内容物，滤纸吸干，用4%多聚甲醛固定后石蜡包埋，制备4 μm切片作HE染色，观察胃黏膜损伤的病理变化，剪1/3胃组织-80 ℃低温保存，用于RT-PCR和western-blot测定。

2.3RT-PCR法测定COX-2、iNOS的mRNA水平组织RNA经Trizol裂解进行常规的RNA提取后，按试剂盒操作，反转录PCR扩增，产物最后经琼脂糖电泳鉴定。选择GAPDH为内参照，利用软件Primer premier 5.0进行引物设计,引物由上海英潍捷基公司合成，iNOS上下游引物序列分别为:5’-CGGTCTTTTCCTATGGAGTGA-3’，5’-CTCTCCAAACCCCTCAACTG-3’，预扩增长度为125。COX-2上下游引物序列分别为：5’-GGTGTCCCTTCGCCTCTT-3’，5’-TTCCACATCGGTTGCTC

C-3’，预扩增长度为565。GAPDH上下游引物序列分别为：5’-TATCGGACGCCTGGTTAC-3’，5’-GGAAGATGGTGATGGGTTT-3’，预扩增长度为194。Quantity one软件测定iNOS/GAPDH及COX-2/GAPDH的相对表达量。

2.4Western-blot检测iNOS、COX-2蛋白的表达取40 mg组织剪碎后加入0.5 mL裂解液充分裂解，匀浆破碎组织，14 000 r/min，4 ℃离心10 min，取上清进行BCA蛋白定量,测定蛋白浓度后行10%SDS-PAGE凝胶电泳，样品上样20～30 μg，电泳100 V恒压后转120 V，转移到PVDF膜300 mA电流恒流湿转，5%脱脂奶粉室温封闭1 h,TBST洗3次，每次5 min，加入稀释后的兔抗鼠一抗(COX-2、iNOS,1∶2 000)，室温孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min，加入稀释后的羊抗兔二抗(1∶5 000)室温孵育40 min，化学发光自显影，以GAPDH为内参对照，进行iNOS和COX-2蛋白的表达分析。

3结果

3.1动物造模的一般情况注射STZ后，大鼠血糖持续升高并陆续发生死亡,糖尿病成模率为75%(诊断标准:非空腹血糖≥16.8 mmol/L)，造模组动物精神倦怠，毛色枯黄，肛周污秽，体型消瘦，饮水、排尿增多，出现糖尿病典型的“三多一少”症状，且通过病理观察发现模型组大鼠出现条索状的胃黏膜糜烂和出血灶，胃壁逐渐变薄，变轻，见有溃疡，胃黏膜层上皮细胞黏液变薄、缺失、细胞间隙变大、有轻度的坏死，胞浆有空泡变形成，毛细血管可见有扩张，炎细胞浸润。大鼠血糖和体质量情况见图1～2。

图1　各组大鼠注射STZ后血糖变化

图2　各组大鼠注射STZ后体重变化

3.2RT-PCR检测胃组织iNOSmRNA、COX-2mRNA的结果琼脂糖凝胶检测到125 bp、565 bp和194 bp 3个条带的产物,各基因片段与预期目的片段长度相符，通过凝胶成像扫描系统做半定量分析，结果显示，与正常组比较，模型组COX-2mRNA、iNOSmRNA、COX-2/GAPDH和iNOS/GAPDH的值均大于正常组，差异有统计学意义(P<0.01)，中药组iNOSmRNA和iNOS/GAPDH的值大于正常组，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，中药组COX-2mRNA、iNOSmRNA和COX-2/GAPDH的值小于模型组，差异有统计学意义(P<0.01，P<0.05)，见表1。

表1　各组大鼠胃组织iNOSmRNA、COX-2mRNA的相对表达量( n=4)

注:与正常组比较,△△P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01

图3　大鼠胃组织iNOS、COX-2的相对表达量

3.3胃组织iNOS、COX-2蛋白的Western blot检测结果胃组织COX-2、iNOS的蛋白表达结果见图3，COX-2/GAPDH和iNOS/GAPDH的比值作比较得出:模型组COX-2/GAPDH的比值高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)，中药组COX-2/GAPDH的比值与正常组差异无统计学意义(P>0.05)，说明补中益气丸能调节COX-2的表达；模型组和中药组的iNOS/GAPDH的比值明显高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。

4讨论

胃肠屏障是抵抗胃肠病理及相关疾病的关键，胃肠屏障破坏，将增加胃肠腔潜在的毒性物质如抗原、毒素、炎性分子等的吸收,促进疾病的发生发展。空腹可导致STZ糖尿病大鼠胃黏膜黏附层胃黏膜胃肠蛋白(MUC)总量减少,引起胃黏膜损伤[13]。实验研究表明[14],STZ糖尿病大鼠高血糖组(STZ注射后3周)iNOS的磷酸化和iNOS活性显著降低。实验证明STZ糖尿病鼠COX-1或COX-2没完全损害[15-16]。MUC、NOS、COX是胃肠黏膜结构性和诱导性的防御屏障。MUC活跃在胃肠黏膜表面，是碳水化合物丰富的糖蛋白，在MUC家族中，MUC1起最主要的作用，cNOS、iNOS、COX-1、COX-2在胃肠黏膜各层均有分布，通过相互协作和相互介导保全胃黏膜的完整性。 COX与NOS之间的相互作用已获得证实，如ATAR S等[17]发现，ATV的心肌保护作用，是通过激活iNOS和COX-2,iNOS是COX-2的上游信号，iNOS通过S-硝基化激活COX-2，免疫共沉淀发现，COX-2和iNOS共存，而不与eNOS共存。LI X等[18]发现磷脂酶A2、iNOS和COX-2形成多蛋白复合物导致磷脂酶A2 S-硝基化和激活。COX-2能加强iNOS诱导的磷脂酶A2的S-硝基化，而最大的PGs合成是通过iNOS、磷脂酶A2和COX-2协作的相互作用获得。在糖尿病状态，大鼠胃黏膜的MUC1、COX-2、iNOS均发生显著变化，MUC1随病程进展逐渐降低，iNOS和COX-2的变化可能主要与病程有关，表现为早期活性可能降低，而晚期活性可能升高。二者相互协作和相互介导的关系，持续催化产生大量NO和6-酮前列腺素Fla，致使黏膜变薄和出血性损伤,黏膜层MUC累积降低。上述结果表明iNOS和COX-2在糖尿病胃黏膜损伤方面起着重要作用，而补中益气丸的胃黏膜保护作用可能这几种蛋白之间的相互作用有关。

参考文献：

[1]CHEN-ROAD HUNG.Effect of lysozyme chloride on betel quid chewing aggravated gastric oxidative stress and hemorrhagic ulcer in diabetic rats[J].World Journal of Gastroenterology,2005,11(37):5853-5858.

[2]PIYACHATURAWAT P,SUWANAMPAI P,KOMARATAT P,et al.Effect of phloracetophenone on bile flow and biliary lipids in rats[J].Hepatology Research,1998,12(3):198-206.

[3]BHOR V M,RAGHURAM N,SIVAKAMI S.Oxidative damage and altered antioxidant enzyme activities in the small intestine of streptozotocin-induced diabetic rats[J].The International Journal of Biochemistry & Cell Biology,2004,36(1):89-97.

[4]MORTEAU O,MORHAM S G,SELLON R,et al.Impaired mucosal defense to acute colonic injury in mice lacking cyclooxygenase-1 or cyclooxygenase-2[J].J Clin Invest,2000,105(4):469-478.

[5]PESKAR B M.Role of cyclooxygenase isoforms in gastric mucosal defense and ulcer healing[J].Inflammopharmacology,2005,13(1/2/3):15.

[6]BURDAN F,SZUMILO J,GAJJAR B,et al.Immunoexpression of constitutive and inducible cyclo-oxygenase isoforms in the rat foetal and maternal digestive tract[J].Folia Morphol (Warsz),2008,67(1):24-31.

[7]SAMONINA G E,ZHUIKOVA S E.Homeostasis in the gastric mucosa and blood circulation.Part 1.Mechanisms of the adequate blood flow maintenance in the gastric mucosa[J].Usp Fiziol Nauk,2001,32(4):60-72.

[8]PLAWKER M W,RABINOWITZ S S,ETWARU D J,et al.Hypergastrinemia,dysuria-hematuria and metabolic alkalosis:complications associated with gastrocystoplasty[J].J Urol,1995,154(2):546-549.

[9]许家骝,张诚光,刘广南.补中益气颗粒剂、汤剂和丸剂对消化性溃疡、慢性胃炎临床疗效观察[J].中药药理与临床,1998(2):43.

[10]陈青.补中益气汤加减治疗糖尿病腹泻34例[J].浙江中医学院学报,2001(1):32.

[11]周黎.补中益气汤加减治疗糖尿病性胃轻瘫40例:附西药治疗30例对照观察[J].浙江中医杂志,1999(11):15.

[12]王雪,李磊.补中益气汤加味治疗糖尿病胃轻瘫30例[J].吉林中医药,2006,26(2):23.

[13]IGARASHI S,KUME E,NARITA H,et al.Food deprivation depletes gastric mucus glycoprotein in streptozotocin-induced diabetic rats[J].Jpn J Pharmacol,2000,84(1):51-55.

[14]LEE D L.Posttranslational regulation of NO synthase activity in the renal medulla of diabetic rats[J].AJP:Renal Physiology,2004,288(1):F82-F90.

[15]HARSCH I A,BRZOZOWSKI T,BAZELA K,et al.Impaired gastric ulcer healing in diabetic rats:role of heat shock protein,growth factors,prostaglandins and proinflammatory cytokines[J].European Journal of Pharmacology.2003,481(2-3):249-260.

[16]BRZOZOWSKA I,TARGOSZ A,SLIWOWSKI Z,et al.Healing of chronic gastric ulcers in diabetic rats treated with native aspirin,nitric oxide (NO)-derivative of aspirin and cyclooxygenase (COX)-2 inhibitor[J].J Physiol Pharmacol,2004,55(4):773-790.

[17]ATAR S.Atorvastatin-induced cardioprotection is mediated by increasing inducible nitric oxide synthase and consequent S-nitrosylation of cyclooxygenase-2[J].AJP:Heart and Circulatory Physiology,2006,290(5):H1960-H1968.

[18]LI X,XU L,GAO H,et al.Effects of grape seed proanthocyanidins extracts on AGEs and expression of bone morphogenetic protein-7 in diabetic rats[J].J Nephrol,2008,21(5):722-733.