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高脂饮食致大鼠脂肪肝实验模型的建立

2015-12-14巴图得力根韩志强娜日苏

中国民族民间医药 2015年15期
关键词:匀浆乳剂高脂

张 伟 巴图得力根 韩志强 娜日苏

1.内蒙古民族大学临床医学院,内蒙古 通辽 028007;2.内蒙古通辽市医院,内蒙古 通辽 028007;3.内蒙古民族大学附属医院蒙药临床药理研究所,内蒙古 通辽 028007

随着人们膳食结构的改变,加上缺乏运动等原因,脂肪肝的发病率逐渐增高。目前,西方发达国家中的脂肪肝发病率为10%~24%,而我国脂肪肝发病率也成为病毒性肝炎之后的第二大肝病,上海和广州两地,脂肪肝的发病率就高达20%。如果不及时治疗,将会进一步恶化,导致肝纤维化甚至肝硬化,严重影响人们的身体健康,给家庭和社会带来很大的负担。本实验旨在探讨脂肪肝模型的复制方法,为进一步研究脂肪肝发病机理提供一种较好的动物模型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 高脂饲料配方 胆固醇(批号:F20030410)、脱氧胆酸钠(批号:F20030410)、吐温80 (批号:F20030410)、1-2 丙二醇(批号:F20030410)均为分析纯,够自西格玛奥德里奇上海贸易有限公司;丙赛优(批号:030505,上海朝晖药业有限公司);猪油自制。

1.1.2 脂肪乳的配制[1]按12.5%吐温80、10%1-2 丙二醇、0.5%丙基硫氧嘧啶、15%猪油、1% 脱氧胆酸钠、5%胆固醇的比例配制。先将猪油30g 放在200ml 的烧杯中,放在磁力搅拌器上加热至40℃水浴中融化,加入10g胆固醇、1g 研细的丙基硫氧嘧啶,充分搅匀,加入适量吐温不断搅拌直至乳化现象产生,制成油相。另一烧瓶中加入30ml 蒸馏水和1-2 丙二醇20ml,加热至60℃,然后加入胆盐2g 溶解,制成水相。将两个烧杯液体充分混匀即可成为稳定的脂肪乳剂,使用时37℃水浴融。

1.1.3 普通饲料 玉米面35.45%,白面29.55%,麸皮12.5%,豆粉12%,鱼粉8%,酵母粉2%。

1.1.4 试剂盒 TG、TC 测定试剂盒(北京福瑞生物工程公司);AST、ALT 考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 方法 雄性清洁级Wistar 大鼠28 只(SCXK 吉-20110-0004),体重(200±10)g。随机抽取8 只作为对照组,用生理盐水灌胃每日1 次,35 d 后腹腔静脉抽血行血脂四项及肝功能检测、肝重测定以及肝脏病理检查。其余20 只大鼠作为高脂乳剂组行脂肪肝模型复制,用高脂乳剂灌胃每日1 次,饲养后的第14、28d 各取5 只大鼠处死,第35d 另取10 只大鼠和对照组8 只大鼠一同处死,腹腔静脉抽血行血脂四项及生化检测、肝重测定以及肝脏病理检查,观察肝脏脂肪变性程度。实验前动物禁食12h,用10%的水合氯醛以0.35ml/l00g[2]体重经腹腔内注射麻醉后开腹,腹下腔静脉采血,取3ml 全血室温静置15min,3000r/min 离心30min 分离血清,备测血脂四项、肝功。各组大鼠于肝右叶取300mg 肝组织标本,冰水中制成10%的匀浆,4℃4000r/min 离心10min,提取上清液,用酶法测定TG、TC 含量。

1.3 检测指标和方法

1.3.1 检测指标 AST、ALT、TC、TG、LDL、HDL 含量;肝匀浆TG、TC 的含量;检测肝组织病理。

1.3.2 检测方法 ①肝功能及血脂四项指标AST、ALT、TC、TG、LDL、HDL 采用全自动生化分析仪检测。②肝匀浆TG 和TC 用全自动生化分析仪检测。③组织病理观察:病理诊断是判断脂肪肝程度的金标准。取材后经10%福尔马林固定3h 后,梯度酒精逐级脱水,石蜡包埋,冷冻,切片厚5μm,HE 染色观察肝脏细胞脂肪变程度和范围。依据脂肪肝评分标准进行评分。

1.4 疗效判定标准组织学疗效评估参照Brunt 等[3]制订的脂肪变分级标准,即0 级:肝细胞脂变细胞占0~5%;I级:肝细胞脂肪变细胞占5%~33%;II 级:肝细胞肪变细胞占33%~66%;III 级:肝细胞脂肪变细胞占66%以上。采用生化指标AST、ALT、TC、TG、LDL、HDL,肝匀浆TG 和TC,来判定肝功能和血脂的疗效。

1.5 统计分析 利用SPSS 13.0 统计软件包对数据进行整理分析,计量资料以(±s)表示,采用t 检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物情况 高脂乳剂灌胃饲养10d 后大鼠皮毛蓬乱而无光泽,精神萎靡,食欲不振,体重减轻。生理盐水组大鼠体重呈增加趋势。

2.2 大鼠体重、肝重、肝指数 与生理盐水组相比,高脂乳剂组肝指数(肝湿重/体重×100%)在第4 周末明显升高(P<0.05),第5 周末这种差异性仍然存在。高脂乳剂组大鼠体重明显小于生理盐水组,肝重相对于高脂乳剂组呈上升趋势,但无统计学意义(P>0.05)。见表1.

表1 生理盐水组和高脂乳剂组大鼠体重、肝重、肝指数的比较(±s)

表1 生理盐水组和高脂乳剂组大鼠体重、肝重、肝指数的比较(±s)

注:与生理盐水组比较,* P ﹤0.05。

2.3 血脂水平情况 高脂乳剂组血清中TC、TG、LDL-C含量从第2 周末就有明显上升(P<0.05),而HDL-C 则明显降低(P<0.05)。且该趋势在第4、5 周末仍然存在差异性。见表2、表3.

表2 生理盐水组和高脂乳剂组大鼠TG、TC 的比较(±s)

表2 生理盐水组和高脂乳剂组大鼠TG、TC 的比较(±s)

注:与生理盐水组比较,* P ﹤0.05。

表3 生理盐水组和高脂乳剂组大鼠HDL-C、LDL-C 的比较(±s)

表3 生理盐水组和高脂乳剂组大鼠HDL-C、LDL-C 的比较(±s)

注:与生理盐水组比较,* P ﹤0.05。

2.4 大鼠肝功能的变化 与生理盐水组相比,高脂乳剂组血清中ALT、AST 从第2 周末就明显上升(P<0.05),且该趋势在第4、第5 周末仍然存在差异性。其中以ALT 变化更为显著。

表4 生理盐水组和高脂乳剂组大鼠ALT、AST 的比较(±s)

表4 生理盐水组和高脂乳剂组大鼠ALT、AST 的比较(±s)

注:与生理盐水组比较,* P ﹤0.05。

2.5 肝内脂质变化 高脂乳剂组肝匀浆TG、肝匀浆TC 从第2 周末就有明显上升(P<0.05),且该趋势在第4、第5 周末仍然存在差异性。其中以肝匀浆TC 变化更为显著。见表5。

表5 生理盐水组和高脂乳剂组大鼠肝匀浆TG、TC 的比较(±s)

表5 生理盐水组和高脂乳剂组大鼠肝匀浆TG、TC 的比较(±s)

注:与生理盐水组比较,* P ﹤0.05。

2.6 肝脏组织学改变 高脂乳剂组大体见肝表面有油腻感,锇酸染色光镜下第14d 肝细胞内有少量脂滴,第28d约1/ 3 肝细胞含有细颗粒状脂滴,第35d 约2/ 3 以上肝细胞内出现脂滴,肝窦被挤压变窄,肝细胞形态不规则。生理盐水组肝脏则未见以上改变。见图1。

3 讨论

脂肪肝是多种病因引起的肝脏脂肪变性,流行病学调查显示,酒精和肥胖是引起慢性脂肪肝的主要原因。20世纪80年代末期日美学者利用B 超检查发现,正常人群脂肪肝发病率约为的10%,而肥胖患者的发病率为50%,嗜酒者的发病率为57.7%。脂肪肝的发病机理至今尚未明确,但通常认为脂肪肝的形成与脂肪代谢障碍有关,是肝细胞脂肪合成增加和氧化减少所致,肝细胞中的甘油三酯、极低密度脂蛋白合成和排出不平衡是形成脂肪肝的原因。目前,高脂血症动物造模方法各异,但主要有先天性、转基因和化学物质诱导的三种实验性动物模型[4]。前两种由于来源困难和代价昂贵,且与人类脂肪肝的形成特点不符合,限制了其应用,导致高脂饲料喂养或灌胃形成的实验动物模型在国内应用最为广泛。但高脂血症动物模型与其他疾病动物造模比较,存在周期过长、费用过高或模型组血脂水平参差不齐等缺点。张东等[5]通过实验结果证明,在猪油和胆固醇的基础上加入丙基硫氧嘧啶,在10d、20d、30d时CHO 和LDL 均升高、且HDL 显著降低,但TG 未见变化;在猪油和胆固醇的基础上同时加入胆盐和丙基硫氧嘧啶,各项指标在不同时期差异均有显著性,说明本配方可以造成理想的高脂血症模型,且造模所需时间最短,10d 即可,稳定性较高,随时间延长,血脂水平也不断升高。倪鸿昌等[6]又在以上配方基础上提出用高脂饲料改良方诱导的脂肪肝动物模型,因其病理特征与人类相似,4 周成为稳定脂肪肝模型,且价格低廉,方法简单而被广泛使用。本实验在倪鸿昌等高脂配方基础上又加以改动,用高脂饲料乳剂每日灌胃诱导大鼠脂肪肝,锇酸染色显示,第14d出现较多的脂滴积累;第28d 超过2/3 以上的细胞内均出现脂滴,并随时间延长小泡状脂滴有相互融合的趋势;第35d 由于肝细胞内充满脂肪空泡,将核推向一边,肝细胞形态不规则,肝窦变窄,不规则。体重小于正常大鼠,肝重大于正常大鼠,可能由于高脂饲料胆固醇高,妨碍鼠的生长发育,致呈现皮毛蓬乱而无光泽,精神萎靡,食欲不振。

[1]倪鸿昌,李俊,金涌,等.大鼠实验性高脂血症和高脂血症性脂肪肝模型研究[J].中国药理学通报,2004,20 (6):703-706.

[2]曾民德.脂肪肝[J].中华消化杂志,1999,19 (2):120-122.

[3]Brunt EM,JarmeyC G,Di Bisceglie AM,et al.Nonalcoholics teatohepatitis:a Proposal for grading and staging the histological lesions [J].Am J Gastroenterol,1999;94:2467-2474.

[4].Matteoni CA,Younossi ZM,Gramlieh T,et al.Nonalcoholic fattyliverdisease:aspectrum of clinical andpathological sevedty [J].Gastroenterology,1999,116:1413-1419.

[5]张东,武海军,陈士萍,等.人鼠实验性高脂血症五种造模方法的比较[J].中国药理学通报,2007,23 (9):1254-1256.

[6].刘嵩,卢笑丛,葛建,等.高脂所致脂肪肝动物模型建立的动态研究[J].中国药理学通报,2006,22 (11):1399-403.

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