刘娇娇，王超，王帅

（东北农业大学园艺学院，黑龙江哈尔滨，150030）

结球甘蓝（Brassica oleraceaL.var.capitataL.），属十字花科芸薹属，为一种重要的蔬菜类作物。由于不结球白菜杂种优势非常明显，目前国内外主要推广的品种大多数为F1代。不结球白菜杂种一代过去主要采用自交不亲和系繁殖，但繁殖成本较高，且亲本生活力易下降，制种时杂交率很难达到100%，容易出现假杂种；利用雄性不育系制种，不仅亲本繁殖容易、杂种一代纯度高，而且有利于新品种的自身保护。

细胞质雄性不育（CMS）是一种不能产生有活力花粉的母性遗传现象，是由线粒体基因组的重排引起的。CMS相关基因产生一种新的蛋白质，直接或间接破坏线粒体正常的生理功能[1]，从而导致花粉败育，研究证明，高等植物CMS与其线粒体基因密切相关。目前比较常见的不育类型主要有波里马不育胞质（Pol CMS）、萝卜不育胞质（Ogu CMS）和甘蓝型油菜不育胞质（Nap CMS）等。芸薹属中波里马不育胞质、萝卜不育胞质研究较多，二者利用比较广泛[2～4]。研究发现，几乎所有的细胞质雄性不育均与线粒体基因变异有关，其中起主要作用的是重要基因和未知片段重组形成的开放读码框（ORF）。人们在分子鉴定方面对不育类型进行了研究，可以有效区分CMS类型。张德双等[5]利用orf138引物证实了所获得的白菜CMS96胞质不育系mtDNA的特异序列与Ogu CMS有高度同源，为Ogu CMS不育类型。王春国等[6]通过设计orf138特异引物对花椰菜细胞质雄性不育系和保持系进行了PCR扩增，证明所用细胞质不育材料为Ogu CMS不育类型。

本试验通过提取甘蓝细胞质雄性不育材料PM和QM mtDNA，设计orf138特异引物对其mtDNA进行PCR扩增，进而通过同源比对来鉴定PM和QM雄性不育的类型，证明2个雄性不育材料的分子类型，为今后研究甘蓝雄性不育的分子机制提供一定的帮助。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2个甘蓝细胞质不育品系PM和QM。

1.2 试验方法

①黄化苗的培育 首先取甘蓝种子1 g左右，用清水冲洗干净，浸泡30 min，然后放置在无菌瓶中，于28℃暗培养 7～10 d（定期更换补充烧杯内水源），长出的黄化幼苗即可作为试验材料。

②mtDNA提取试剂 DNaseⅠ、RNase A、蛋白酶K均为Takara产品，其余均为国产分析纯。a.匀浆缓冲液。0.4 mol/L甘露醇；50 mmol/L Tris-HCl，pH值 7.5；20 mmol/L EDTA-Na2；1.0 mol/L NaCl；0.2%BSA；0.1%半胱氨酸；1%PVP（BSA、半胱氨酸和PVP在试验前加）。

b.酶解缓冲液。0.4 mol/L甘露醇；50 mmol/L Tris-HCl，pH 值 7.5；10 mmol/L MgCl2；0.1%BSA（试验前加）。

c.Shelf缓冲液。0.5 mmol/L甘露醇；10 mmol/L Tris-HCl，pH 值 7.5；20 mmol/L EDTA-Na2。

d.裂解缓冲液。50 mmol/L Tris-HCl，pH 值 8.0；20 mmol/L EDTA-Na2；5%SDS；0.1 mol/L NaCl；0.01%β-巯基乙醇。

e.EDTA溶液。0.5 mol/L，pH值8.0。

f.DNaseⅠ溶液。1 U/mL。

g.蛋白酶K溶液。20 mg/mL。

h.乙酸钠溶液。3 mol/L。

③线粒体提取 a.称取20 g结球甘蓝黄化苗，在冰水中冲洗10 min后擦干，放入盛有100 mL匀浆缓冲液的烧杯中，置于4℃冰箱15～30 min（黑暗条件下）。

b.在匀浆机中高速匀浆，每次约15 s，重复5次。用8层纱布过滤匀浆液于预冷的50 mL离心管中，滤液于1 000 r/min离心10 min。

c.取上清液2 000 r/min离心10 min后，再取上清液于2 000 r/min离心15 min，重复1次，弃上清液，得到粗线粒体沉淀。

d.向每管沉淀中加入20 mL预冷的匀浆缓冲液，悬浮沉淀，于20 000 r/min离心15 min，充分弃掉上清液，得粗线粒体沉淀。

e.在粗线粒体沉淀中加入1 mL预冷的酶解缓冲液，悬浮沉淀于2个离心管中，后每管加入5 mL酶解缓冲液，15 mL DNaseⅠ，混匀后室温放置，每5 min轻轻摇动悬浮液1次，30 min后放入冰浴中1 h。之后每管加入600 μL EDTA溶液，混匀后室温静止10 min终止DNaseⅠ消化反应。

f.将上述溶液小心铺于Shelf缓冲液上（每管25 mL），于18 000 r/min离心20 min后收集沉淀。再用6 mL酶解缓冲液重新悬浮线粒体沉淀，并将悬浮液缓慢铺于Shelf缓冲液上（每管15 mL），于18 000 r/min离心20 min，所得沉淀即为纯化的线粒体。

④mtDNA提取方法 a.向每管沉淀中加入6 mL酶解缓冲液，轻轻混匀后，分装到6个2 mL离心管中，于18 000 r/min离心15 min后弃上清液。

b.每管沉淀中加入0.9 mL裂解缓冲液，5 μL蛋白酶K，用枪头吸打沉淀，使沉淀在裂解缓冲液中混匀，65℃水浴1 h，同时轻摇。

c.向裂解液中加入100 mL NaAc，然后加入等体积的苯酚+氯仿+异戊醇混合液（三者体积比25∶24∶1），缓慢混匀 10 min 以上，12 000 r/min 离心10 min抽提DNA，收集上清液，并重复抽提一次。

d.向上清液中加入 RNaseA 酶（10 mL/mL），37℃条件下反应1 h，同时轻摇。

e.加入等体积的苯酚+氯仿+异戊醇混合液（三者 体 积 比 25∶24∶1），缓慢混匀 10 min 以上 ，于12 000 r/min离心10 min抽提DNA，收集上清液，并重复抽提一次。

f.向上清液中加入1/10体积的NaAc和2倍体积预冷的无水乙醇，-20℃过夜沉淀，于18 000 r/min离心20 min，收集沉淀。

g.沉淀用70%乙醇洗涤3次，置超净工作台上吹干，溶于30 mL超纯水中，-20℃保存备用。

⑤引物设计与合成 根据orf224和orf138基因序列的保守区设计特异引物，委托苏州金唯智公司进行引物的合成（表1）。

⑥PCR扩增 20 mL反应体系中含1×PCR缓冲液、2.0 mmol MgCl2、2.0 mmol dNTP、1 μL DNA、2条引物各 0.5 μmol、1 U Taq酶，用 ddH2O补足。PCR 扩增程序：94℃预变性 2 min；94℃变性 30 s，53℃（根据Tm设定）退火1 min，72℃延伸2 min，40个循环；72℃保温延伸5 min，4℃下保存。扩增产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结束后在紫外灯下观察照相。

⑦特异条带回收、纯化及mtDNA序列分析 按照大连宝生物有限公司试剂盒的使用说明方法回收纯化，回收纯化后的mtDNA于4℃贮存备用。连接体系为 5 μL，0.5 μL pGEM-T 载体，0.5 μL 连接酶，2.5 μL 2×连接酶，1.5 μL PCR 产物。经蓝白斑筛选，EcoRⅠ酶切、电泳检测后委托苏州金唯智生物技术有限公司进行DNA测序。用DNAMAN软件进行同源性序列比对分析。

2 结果与分析

2.1 甘蓝不育材料mtDNA检测结果

经测定，提取的mtDNA的OD260/OD280值在1.6～1.8，OD260/OD230>2.0，0.8%琼脂糖凝胶电泳结果显示，电泳条带清晰（图1），表明所提取的mtDNA质量满足进行后面试验的要求。

表1 基于orf224和orf138基因设计的特异引物

2.2 orf138和orf224特异引物的PCR结果

用设计的orf138、orf224特异引物对2个甘蓝供试材料的mtDNA进行PCR扩增。用orf138设计的特异引物对2个甘蓝材料进行PCR扩增，2个不育系PM、QM均扩增出350 bp左右的条带（图2）；而用设计的orf224特异引物对2个不育材料进行PCR扩增，不育系均没有扩增产生条带。

图1 甘蓝mtDNA的0.8%琼脂凝胶电泳图谱

图2 orf138引物PCR扩增产物电泳图谱

2．3 序列的同源性比较

利用pGEM-T载体连接，经蓝白斑筛选，EcoRⅠ酶切、电泳检测，条带清晰明显（图3），故可以进行测序，选用orf138特异引物扩增出条带的供试材料克隆进行测序。

利用DNAMAN软件对测序结果进行分析，结果表明，这2个序列都与已知的萝卜Ogura雄性不育线粒体基因组的部分序列存在很高的相似性，但是有个别位点存在差异，2个片段与Ogu型胞质不育萝卜线粒体开放读码框orf138同源性均为92.55%（图4），长度为297 bp，证明2个来源不同的甘蓝雄性不育供试材料均属于萝卜细胞质不育类型Ogu CMS。

图3 质粒EcoRⅠ酶切电泳图

图4 2个甘蓝不育系与Ogu CMS萝卜orf138核苷酸序列同源性比较

3 讨论与结论

在十字花科作物的细胞质雄性不育材料中，已经发现了很多特异性存在于不育系的开放阅读框中，如不育系甜菜的orf239、萝卜的orf138、白菜的orf222、油菜的orf224及芥菜的orf220等[7]。Ogu CMS是于1968年在日本鹿儿岛一个萝卜品种留种田中发现的一种新型胞质不育系，是目前国内外十字花科芸薹属中应用较为广泛的一种不育类型。李建斌等[8]利用多个结球甘蓝胞质雄性不育材料，通过对orf138和orf222基因进行PCR，结果显示其中的59个材料含有orf138。张艳等[9]利用Ogu CMS的orf138特异引物及Nap CMS和Pol CMS的共同引物，在15份甘蓝CMS材料中鉴定出了有14份是Ogu CMS。本文通过已知引物设计了2组特异引物，发现orf138特异引物在甘蓝雄性不育材料都有扩增产物，orf224特异引物在甘蓝雄性不育材料没有扩增产物。经测序分析后发现，这2个来源不同的甘蓝雄性不育材料与Ogura型胞质不育萝卜线粒体开放阅读框orf138的同源性高达92.55%，表明这2个甘蓝雄性不育材料均属于Ogura胞质不育类型，为今后甘蓝细胞质雄性不育系在育种中的应用奠定了基础，并为实现优势育种提供了分子依据。

鉴别雄性不育系的不育类型有助于掌握其遗传规律和遗传机理，为人工合成保持系或者合理利用雄性不育系提供理论基础。本文通过利用PCR快速鉴定了2个甘蓝细胞质雄性不育材料，证明了供试材料的细胞质雄性不育类型为Ogura胞质不育类型，为进一步有效地开展细胞质雄性不育系在育种中的应用奠定了基础。

[1]Hanson M R.Plant mitochondrial mutations and male sterility[J].Annual Review of Genetics,1991,25:461-486.

[2]侯喜林，曹寿椿，吴志行.十字花科作物几种主要细胞质雄性不育类型及其利用[J].长江蔬菜，1999（5）：1-3.

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[4]周邦福，李显石，石磊.天津型大白菜雄性不育系的选育及利用[J].湖南农业大学学报：自然科学版，2008，34（2）：190-192.

[5]张德双，徐家炳，曹鸣庆，等.大白菜转育新型甘蓝型油菜细胞质雄性不育系的研究[J].华北农学报，2002，17（1）：60-63.

[6]王春国，宋文芹.花椰菜细胞质雄性不育基因特异PCR标记的筛选[J].遗传，2005，27（2）：236-240.

[7]张明方，杨景华，陈竹君.十字花科作物细胞质雄性不育的分子机理[J].农业生物技术学报，2003，11（5）：538-544.

[8]李建斌，张海娟，余小林，等.结球甘蓝细胞质雄性不育（CMS）类型的分子鉴定[J].分子植物育种，2009，7（6）：1 149-1 153.

[9]张艳，王小佳，李成琼.甘蓝细胞质雄性不育材料分子鉴定及花器官形态对核背景的响应[J].园艺学报，2010，37（6）：912-915.