黄巧丽， 李 涛， 姜科声， 刘羿男， 李贤慧， 刘元伟

(1.浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华 321004;2.北京大学医学部细胞生物学系，北京100191;3.武警后勤学院生物化学与分子生物学教研室，天津 300162;4.浙江医院心内科，浙江杭州 310013)

p38信号通路参与P19CL6细胞早期心肌分化
*

黄巧丽1， 李 涛1， 姜科声1， 刘羿男2， 李贤慧3， 刘元伟4

(1.浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华 321004;2.北京大学医学部细胞生物学系，北京100191;3.武警后勤学院生物化学与分子生物学教研室，天津 300162;4.浙江医院心内科，浙江杭州 310013)

以P19CL6小鼠畸胎瘤细胞心肌分化为模型，研究了p38信号通路在干细胞心肌分化早期阶段的作用.在诱导剂二甲基亚砜作用下，P19CL6细胞分化为自发跳动的心肌细胞，表达心肌标志性基因.在诱导分化过程中，p38信号通路活化.采用特异性抑制剂SB203580在早期分化阶段封闭p38信号通路，结果发现:高剂量SB203580诱导细胞凋亡;低剂量SB203580抑制心肌祖细胞标志基因GATA4和Nkx2.5的表达，并显著下调生心性信号分子BMP2和BMP4的表达.而过表达p38 α质粒则能促进P19CL6细胞表达GATA4和Nkx2.5.表明p38信号通路正性调控P19CL6细胞的早期心肌分化，并维持细胞的增殖和存活能力.

P19CL6细胞;心肌分化;p38激酶;信号通路

干细胞向心肌分化的过程中，首先分化为中胚层细胞，继而分化为心肌前体干细胞，最终发育为自发搏动的功能性心肌细胞.在心肌多步骤程序分化过程中，涉及到多个信号通路的时空启闭，包括骨形成蛋白(BMP)、Wnt和Notch等信号通路.已证实Wnt和Notch信号促进心肌早期分化，但抑制晚期分化.这表明信号通路的时空启闭关乎干细胞在分化道路上的命运选择［1］.目前干细胞研究中一大热点是:利用小分子化合物对特异的信号通路进行调制，从而引发定向分化或增强诱导分化效率［2］.

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，存在于大多数细胞内，在介导胞内信号转导中发挥着重要的作用.MAPK通路大致分为p38，ERK，JNK和ERK5四个亚家族，通过对不同底物蛋白的磷酸化修饰，将胞外刺激信号转导至胞内，引发细胞生物学反应，广泛参与了细胞的增殖、分化、凋亡等生物学事件［3］.

本文对p38信号通路在P19CL6细胞早期心肌分化中的作用进行了初步研究.P19CL6细胞是Habara－Onkubo等将小鼠P19畸胎瘤细胞经过多次传代建立的一个亚细胞系，分化潜能主要表现为中胚层方向定向分化.与P19细胞需要悬浮诱导不同的是，P19CL6细胞在贴壁条件下经二甲基亚砜(DMSO)诱导，可以简便高效地获得分化的心肌细胞.P16CL6细胞已经成为比较公认的研究干细胞向心肌细胞分化的细胞模型.采用经典的二甲基亚砜诱导P16CL6细胞8～12 d，分化效率可达到70%～90%.

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

P19CL6小鼠畸胎瘤干细胞为北京大学医学部周春燕教授惠赠.pcDNA3－HA－p38 α质粒由以色列大学Engelberg教授馈赠;pEGFP－N1质粒为Clontech公司产品.Lipofectamine 2000购自 Invitrogen公司，总RNA提取试剂(RNAVzol)及质粒提取试剂盒购自北京威格拉斯公司，Annexin V凋亡检测试剂盒购自北京宝赛公司;MMLV反转录酶购自 Promega公司;Taq DNA聚合酶购自New England Biolabs公司;Hoechst33342购自Sigma公司.SB203580和BCA法蛋白定量试剂盒购自碧云天公司，抗α－actinin抗体购自Sigma公司，抗p－p38和总p38抗体购自Cell Signaling公司，抗GAPDH抗体、辣根过氧化酶及FITC标记的二抗均购自北京中杉金桥公司.PCR引物由北京奥科公司合成.

1.2 P19CL6细胞的培养及贴壁诱导分化

液氮冻存的P19CL6细胞解冻后常规培养传代，培养于:α－MEM培养基 +10%胎牛血清(FBS)+100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素(双抗).将P19CL6细胞进行消化、计数，按3.7×105细胞密度用含1%二甲基亚砜(细胞培养级)的诱导培养基接种于直径60 mm的细胞培养皿内.待细胞贴壁后，每隔2 d换液1次.诱导当天记为0 d.贴壁诱导6 d后撤除二甲基亚砜，继续培养，隔天换液.

1.3 噻唑蓝(MTT)法检测细胞相对活力

将P19CL6细胞以1.8×104/孔接种至96孔板上，1%二甲基亚砜诱导，同时加入不同剂量的SB203580(0，5，10，20 μmol/L).37℃孵育48 h后终止培养，弃去孔内培养液.每孔加入150 μL二甲基亚砜，低速振荡10 min，使结晶充分溶解.在酶联免疫检测仪490 nm波长处测量各孔的吸光度(A490nm).按下列公式计算细胞存活率:

每组设4个复孔，实验重复3次，用配对t检验法进行统计分析.

1.4 逆转录PCR及实时PCR

RNA提取方法参照产品说明.在1×106细胞中加入1 mL总 RNA提取试剂，冰上放置5 min，使细胞裂解;加入0.2 mL氯仿，振荡混匀，冰上静置2 min，使核蛋白解离;4℃12 000 r/min离心15 min;取上清，加入0.5 mL异丙醇，颠倒混匀，冰上静置10 min;4℃ 12 000 r/min离心10 min;弃上清，在RNA沉淀中加入1 mL 75%乙醇溶液混匀;4℃7 500 r/min离心10 min;弃上清，充分晾干，加入焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液溶解，测定其浓度及纯度.取5 μg总RNA经MMLV逆转录酶逆转录成cDNA作为PCR的模板.将5 μg总RNA与2 μL随机引物溶液(0.5 μg/μL)混合，加DEPC水溶液补足至终体积12.5 μL.70℃水浴变性5 min，置冰上2 min.每管中再加入以下试剂:4 μL反应缓冲液，2 μL脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)溶液(10 mmol/L)，0.5 μL RNA酶抑制剂溶液(40 U/μL)，1 μL MMLV溶液(200 U/μL).加DEPC水溶液补足至20 μL后混匀，轻离心，37℃反应1 h.70℃灭活5 min，离心1 min，－80℃保存备用.

PCR引物及扩增条件为:18s基因正向引物5'－GTAACCCGTTGAACCCCAATT－3'，反向引物5'－CCATCCAATCGGTAGTAGCG－3，扩增条件为58℃退火，共25个循环，产物大小151 bp;GATA4基因正向引物5'－CTCGATATGTTTGATGACTTCT－3'，反向引物5'－CGTTTTCTGGTTTGAATCCC－3'，扩增条件为60℃退火，共40个循环，产物大小为400 bp;α－MHC基因正向引物 5'－ACCGTGGACTACAACAT－3'，反向引物5'－CTTTCGCTCGTTGGGA－3'，扩增条件为60℃退火，共35个循环，产物大小为287 bp.

实时PCR采用TOYOBO公司的SYBR Green Real－time PCR Master Mix在ABI7700型定量PCR仪上进行.反应体系为:7.5 μL 2×SYBR Green Master Mix缓冲液，0.25 μL正向引物溶液(10 pmol/μL)，0.25 μL反向引物溶液(10 pmol/μL)，1 μL cDNA模板溶液，灭菌去离子水补足至15 μL.PCR反应条件:95℃变性10 min，95℃15 s，60℃1 min，40个循环.测定样品的Ct(Cycle threshold，循环阈值)，通过计算2－△△Ct来比较不同样品之间特定基因的表达差异.结果来自2次平行实验各3次重复，以平均值±标准差的形式在柱状图中显示.PCR引物见表1.

表1 引物序列信息

1.5 免疫荧光鉴定

用细胞刮轻轻刮取跳动细胞团，离心，弃上清;将沉淀加入到含有OCT包埋剂的Eppendorf管内，然后浸入液氮中速冻15 s;置冰冻切片机上切片，切片厚度要求为7 μm，60℃烘干.4%多聚甲醛溶液于室温固定切片15 min;0.5%的Triton X－100/磷酸盐缓冲液(磷酸盐吐温缓冲液)膜打孔10 min;2%牛血清白蛋白(BSA)溶液37℃孵育30 min，以封闭非特异性结合位点;2%BSA溶液稀释的抗α－actinin抗体(1∶200稀释)，4℃孵育过夜;磷酸盐吐温缓冲液漂洗3遍后加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的荧光二抗，湿盒内避光孵育30 min;磷酸盐吐温缓冲液充分漂洗后，1 μg/mL Hoechst33342核复染色5 min，漂洗后，缓冲甘油封片(V(磷酸盐缓冲液)∶V(甘油)= 1∶9)，置荧光显微镜(Fluoview300，Olympus)下观察.

1.6 蛋白印迹

用冰预冷的磷酸盐缓冲液将细胞洗2遍，将细胞刮下收集到Eppendorf管中，5 000 r/min离心5 min沉淀细胞，加入预冷的裂解缓冲液(50 mmol/L Tris－HCl，pH 8.0，150 mmol/L NaCl，0.1%十二烷基磺酸钠(SDS)，1%壬基酚聚氧乙烯醚(NP－40)，0.5%脱氧胆酸钠)，将细胞重悬，冰上孵育30 min后，12 000 r/min离心15 min，上清即为全细胞裂解液.BCA法进行蛋白定量.30 μg蛋白煮沸后，10%SDS－PAGE电泳转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h后加入一抗杂交，辣根过氧化物酶标记二抗孵育后化学发光法显色.

1.7 流式细胞仪检测细胞凋亡

P19CL6细胞经胰酶消化收集:每样本细胞数为1×106，1 000 r/min离心3 min弃去培养液.用结合缓冲液洗涤1次，1 000 r/min离心5 min.用100 μL的Annexin V－FITC标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育15 min，1 000 r/min离心5 min，沉淀细胞用孵育缓冲液洗1次.上机前5 min碘化丙啶(PI)染色.流式细胞仪分析:流式细胞仪激发光波长用488和515 nm的通带滤器检测FITC荧光，大于560 nm的滤器检测PI.

1.8 质粒提取及转染

质粒大量提取方法见威格拉斯公司产品说明书.转染的前一天，消化细胞、计数.以4×105/孔细胞浓度接种于6孔板中，当细胞汇合度达80%～90%时开始转染.每孔细胞需2 μg纯化质粒，用50 μL无血清、无双抗的培养基稀释.每孔细胞需要4 μL Lipofectamin2000，用50 μL无血清、无双抗的培养基稀释，混匀后室温静置5 min.分别将质粒与脂质体充分混匀，室温静置20 min，将混合物加入6孔板，轻摇使其均匀分布在孔板内.将细胞放置于CO2培养箱中37℃培养.6 h后将培养基更换为含1%二甲基亚砜的诱导培养基继续培养.

1.9 统计方法

数据以均值±标准差表示，采用SPSS13.0统计软件进行t检验和单因素方差分析.P＜0.05表示有显著性差异，P＜0.01表示有非常显著性差异.

2 结果

2.1 P19CL6细胞心肌诱导分化模型的建立

如图1(a)所示，常规培养的P19CL6细胞贴壁生长，呈不规则长梭形，立体感强，边缘光滑，具有折光性.用1%二甲基亚砜对其进行诱导，细胞汇合后以集落的方式生长，在单层的细胞上可见许多个复层生长的细胞团，类似胚胎干细胞诱导分化过程中形成的“拟胚体样”结构，即发生三胚层分化，经外胚层和内胚层释放的信号分子诱导中胚层细胞定向分化为心肌细胞.诱导后的8 d，在细胞复层生长的区域开始零星出现跳动的细胞群.随着诱导分化继续进行，自发节律性跳动的细胞团数目逐步增加，搏动区域连接成片，一般于诱导12 d达到高峰，最高有80%的细胞团产生跳动.

将未诱导的P19CL6细胞及诱导12 d的细胞冰冻切片，分别进行心肌细胞特异的α－辅肌动蛋白(α－actinin)免疫荧光染色.如图1(b)所示，未诱导的P19CL6检测不到心肌细胞α－辅肌动蛋白的表达，而诱导12 d的P19CL6大部分细胞都表达α－辅肌动蛋白，表明P19CL6细胞被成功诱导为心肌细胞.

图1 P19CL6细胞的心肌分化

2.2 p38激酶在心肌诱导分化过程中活化时相的变化

心肌细胞的分化是一个按照既定分子程序进行的过程，但在分化过程中根据特异性基因的表达，可以划分出几个关键性的分化阶段.干细胞向心肌分化的启动阶段为中胚层分化，其后分化为生心性中胚层，细胞分化为心肌定向祖细胞，标志为心肌特异转录因子GATA4，Nkx2.5的表达;然后由心肌特异转录因子启动心肌结构基因、功能性基因表达，如α肌球蛋白重链(α－MHC);其后已分化的心肌细胞逐步成熟，最终表现出自发性节律性搏动.通过RT－PCR检测P19CL6细胞诱导分化过程中分化标志基因的表达，可以发现:未分化的P19CL6细胞不表达GATA4和α－MHC;分化4 d可检测到GATA4表达;分化8 d方可检测到α－MHC表达(见图2(a)).据此，可将P19CL6细胞心肌分化大致划分为早期(1～4 d)、中期(4～8 d)和晚期(8～12 d)3个阶段，其中早期阶段主要的细胞分子事件为干细胞分化为心肌祖细胞，表达GATA4等标志基因.

为了解p38通路是否参与心肌程序分化，提取各分化阶段的P19CL6细胞蛋白进行蛋白印迹实验，通过检测活化形式的磷酸化p38来了解p38通路在心肌分化过程中是否活化.如图2(b)所示，p38蛋白磷酸化水平随分化过程逐步增强，提示p38通路参与心肌程序分化.

2.3 SB203580对细胞存活和凋亡的影响

为了解p38通路是否参与心肌程序分化，使用特异性抑制剂SB203580封闭p38激酶活性，检测抑制 p38通路对心肌分化的影响.首先在P19CL6细胞分化培养基中加入不同剂量的SB203580，培养2 d后经MTT实验检测细胞相对活力.结果显示，高剂量(20 μmol/L)SB203580极大地抑制了细胞活力，而较低剂量(1，5 μmol/L) SB203580对细胞活力影响较小(见图3(a)).进一步检测发现，20 μmol/L SB203580诱导2 d，导致细胞大量脱落漂浮(见图3(b)).通过Annexin V－PI双染流式分析发现，20 μmol/L SB203580诱导P19CL6细胞凋亡(见图3(c)).统计发现，SB203580组(79.7±5.0)%的细胞发生凋亡，而对照二甲基亚砜诱导组细胞凋亡率为(5.6±2.7)%(见图3(d)).这些结果表明，p38信号通路参与了P19CL6细胞早期分化阶段，起维持细胞正常活性及增殖的作用，阻断p38信号通路可诱发细胞凋亡.

图2 P19CL6分化期间p38级联反应激活

图3 高浓度SB203580诱导早期分化阶段P19CL6细胞凋亡

2.4 SB203580对P19CL6细胞早期分化的抑制

低剂量SB203580对P19CL6细胞无明显的毒性，基本不影响细胞增殖，不诱发凋亡.P19CL6细胞诱导分化1～4 d中持续加入1或5 μmol/L SB203580，4 d末提取RNA进行实时PCR，结果发现，5 μmol/L SB203580抑制GATA4，Nkx2.5的表达(见图4(a)和(b)).表明抑制p38信号通路导致心肌早期分化效率明显降低，降低了心肌特异性转录因子的表达，抑制了心肌祖细胞的产生，提示p38信号通路正性调控早期心肌分化.

为进一步探究p38信号通路调控早期心肌分化的机制，通过实时PCR检测心肌分化关键信号分子BMP2和BMP4的表达.结果发现，P19CL6细胞心肌分化过程中BMP2和BMP4的表达明显增高，但5 μmol/L SB203580处理显著抑制了二者的表达(见图4(b)和(c)).本结果提示，p38信号通路诱导生心性信号分子的表达，正性调控早期心肌分化.

图4 低浓度SB203580抑制P19CL6细胞早期分化

图5 p38α过表达促进P19CL6细胞早期分化

2.5 过表达p38信号对P19CL6细胞早期分化的促进

为进一步明确p38信号通路对早期心肌分化的调控，进行了p38α质粒过表达实验.如图5(a)所示，通过脂质体介导的质粒转染，实验组P19CL6细胞获得了p38蛋白的高表达.EGFP或p38α质粒过表达的P19CL6细胞，再按常规程序经1%二甲基亚砜诱导4 d后提取RNA，通过实时PCR检测早期心肌分化标志基因的表达.结果如图5(b)和(c)所示，p38α蛋白过表达组的GATA4和Nkx2.5基因表达明显增高，其中GATA4基因表达增高了(3.0±0.3)倍，Nkx2.5基因表达增高了(1.7±0.3)倍.因此，本实验证明p38信号通路正性调控早期心肌分化.

3 讨论

干细胞具有全能性、无限增殖和多向分化的潜能，能分化为包括心肌在内的多种细胞，为缺血性心脏病的彻底治愈提供了希望.如何提高干细胞向心肌分化的效率是目前的研究热点［1－2］.利用小分子化合物在特定发育阶段，特别是分化早期对特异的信号通路进行调控，是改善诱导分化效率的重要发展方向.

干细胞向心肌细胞分化有一定的程序过程.经历了从多潜能干细胞向前体心肌祖细胞分化，最终发育为终末分化成熟心肌细胞的程序化过程，涉及细胞内复杂的信号转导及基因调控过程.已发现多个信号分子在心肌分化的调控中发挥了关键作用，包括BMP，Wnt，Notch和FGF等，对心肌分化的影响呈现阶段特异性特征.这启迪了研究者根据心肌分化的特定时间段改变诱导剂组分，以一种“多阶段性”的方式诱导干细胞向心肌分化［1－2］.多个研究报告显示，BMP2，BMP4及同家族的Activin A蛋白均可诱导干细胞向心肌分化，但使用BMP信号通路的抑制剂dorsomorphin亦能大幅促进心肌分化，关键在于dorsomorphin加药阶段只能限于起始分化最早的24 h［4］.由于Wnt信号促进心肌早期分化，但抑制晚期分化，在干细胞早期分化阶段添加 Wnt信号激动剂CHIR99021，或在细胞发育为中胚层细胞后添加Wnt信号抑制剂KY02111，均可促进干细胞向心肌的分化［5－6］.

调制MAPK通路可以影响心肌分化.MAPK信号通路家族是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，与细胞增殖分化关系密切，其家族成员中ERK激酶通路通常介导生长因子信号，而p38和JNK激酶通路通常介导应激性信号，包括各种理化刺激、炎症及细胞因子刺激，ERK4激酶通路通常参与增殖及压力应激信号的传导［3］.在胚胎干细胞中的研究发现，p38信号通路在心肌早期分化阶段发挥着重要作用.p38信号通路的开启与否决定了干细胞的早期分化命运.p38激酶活化的细胞选择中胚层分化道路，最终分化为心肌细胞、骨骼肌细胞、平滑肌等中胚层来源的组织细胞;而p38激酶活性抑制的细胞选择发育为外胚层细胞，最终分化为神经细胞.因此，p38信号通路可以发挥“开关”的作用，调控干细胞的分化方向，可能与调控p53蛋白的稳定性相关［7－10］，但具体机制尚不清楚.此外，p38通路也参与了晚期心肌分化.在异丙肾上腺素、血管紧张素诱导的胚胎干细胞晚期心肌分化中，抑制p38激酶会降低自发搏动的拟胚体数目，抑制心肌标志基因的表达［11－12］.

本实验通过抑制剂及质粒转染实验，在P19CL6畸胎瘤干细胞中验证了p38信号通路对于早期心肌分化的关键作用.本研究发现，高剂量的p38激酶抑制剂SB203580处理阻断了早期分化的P19CL6细胞增殖，大量诱导凋亡，提示p38信号通路维持了早期分化阶段干细胞的增殖和存活能力.尽管文献中经常使用20 μmol/L剂量的SB203580封闭p38通路，同时并不干扰细胞的存活，但在本实验中却出现了大量的细胞凋亡，推测原因为在直径60 mm的皿中P19CL6细胞诱导分化的铺板密度为3.7×105细胞，细胞密度极低，因此无法耐受高剂量的SB203580.适度剂量的SB203580则干扰心肌早期分化，导致定向心肌祖细胞标志基因GATA4，Nkx2.5显著下调.同时，SB203580抑制了生心性关键信号分子BMP2和BMP4的表达.由于BMP信号对GATA4和Nkx2.5基因的表达有重要的诱导作用，因此封闭p38通路可以阻断心肌分化的进程.p38表达质粒转染实验同样证明了 p38通路可以诱导 GATA4和Nkx2.5的表达，从而促进早期心肌分化.总的来说，本实验显示，p38信号通路在P19CL6细胞心肌分化的早期阶段发挥了重要作用，主要体现在维持细胞增殖和存活能力，驱动向定向心肌祖细胞的分化.

本实验的结果提示，早期活化p38通路具有提高心肌分化效能的潜力.但不可忽视的是，亦有文献报道心肌分化早期抑制p38通路能够微弱地促进心肌分化［13－14］，显示了p38通路在细胞分化中的复杂作用.例如，在BMP2诱导的骨髓间充质干细胞心肌分化过程中，加入SB203580反而能促进心肌标志物的表达［15］.干细胞诱导分化受到细胞系、血清、诱导剂种类、剂量等多种因素的影响.本实验采用P19CL6畸胎瘤细胞系，并采用贴壁诱导，与文献［13－14］报道的用胚胎干细胞拟胚体培养、END2条件培养基诱导存在一定的差异.因此，本实验通过SB203580抑制p38通路，未发现明显的促心肌分化效应.总之，由于p38通路在干细胞分化中的重要作用，对其具体的作用及机制仍需要进行进一步的实验研究.

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(责任编辑 薛 荣)

The effect of p38 cascade in the early differentiation of P19CL6 cells towards cardiomyocytes

HUANG Qiaoli1， LI Tao1， JIANG Kesheng1， LIU Yinan2， LI Xianhui3， LIU Yuanwei4

(1.College of Chemistry and Life Sciences，Zhejiang Normal University，Jinhua Zhejiang 321004，China;2.Department of Cell Biology，Health Sciences Center，Peking University，Beijing 100191，China;3.Department of Biochemistry and Molecular Biology，Logistics University of CAPF，Tianjin 300162，China;4.Department of Cardiology，Zhejiang Hospital，Hangzhou Zhejiang 310013，China)

It was estimated the effect of p38 cascade in the early stage of cardiac differentiation using P19CL6 mouse pluripotent carcinoma stem cells.In the presence of DMSO，P19CL6 cells were successfully induced to differentiate into spontaneously contracting cardiomyocytes characterized by the expression of cardiac－specific genes.It was observed the activation of p38 cascade during the differentiation process.Treatment with a high concentration of SB203580，a specific inhibitor of p38 kinase，significantly induced apoptosis of P19CL6 cells.Meanwhile，SB203580 at a low concentration greatly hampered the expression of cardiac marker genes GATA4 and Nkx2.5，and decreased the expression of cardiac differentiation－promoting factors such as BMP2 and BMP4.Additionally，overexpression of p38 α plasmids facilitated the expression of GATA4 and Nkx2.5.Taken these together，these results indicated that p38 cascade exerted a positive effect on the early differentia－tion of P19CL6 cells，and played an important role in maintaining cell growth and survival.

P19CL6 cells;cardiac differentiation;p38 kinase;signaling pathway

Q254

A

1001－5051(2015)01－0095－08

�:2014－03－11;

2014－06－27

国家自然科学基金资助项目(31101057;31470082);浙江省自然科学基金资助项目(LY14C120001)

黄巧丽(1990－)，女，浙江嵊州人，硕士研究生.研究方向:分子发育生物学.

李 涛.E－mail:litao@zjnu.cn

10.16218/j.issn.1001－5051.2015.01.016