章子贵， 孙 岩， 郑祥仁

(浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华 321004)

慢性氟中毒致学习记忆损伤的脑内突触机制*

章子贵， 孙 岩， 郑祥仁

(浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华 321004)

探讨了慢性氟中毒致学习记忆损伤的脑内机制.选用初断乳雄性SD大鼠192只，随机分为4组:1个对照组，饮用自来水;3个分别饮用15，30和60 mg/L NaF溶液的染氟组.染氟期为18月.每3月用开场行为和Morris水迷宫法检测大鼠的学习记忆行为;分别在染氟中期(9月)和染氟结束后(18月)分2批断头处死大鼠，进行脑海马突触体膜流动性和海马CA3区突触后致密蛋白－95(PSD－95)表达水平等检测.结果表明:慢性氟中毒致大鼠自发活动和探究行为显著或极显著抑制，空间学习记忆能力显著下降;脑海马突触膜流动性、PSD－95表达水平均显著下降.提示慢性氟中毒致脑海马突触体膜流动性和突触后致密蛋白－95表达水平的改变可能是慢性氟中毒致学习记忆损伤的脑内突触机制之一.

慢性氟中毒;海马;突触后致密蛋白－95;学习记忆;膜流动性

氟中毒是世界范围内广泛存在的一种人畜共患性地方病，其对机体骨相器官的损害主要表现为氟斑牙和氟骨症［1－2］，对肝脏和大脑等非骨相器官也有广泛的毒性作用［3－4］.氟中毒按类型可分为饮水型、燃煤型和饮茶型3类［5－7］.我国地氟病分布于1 300多个县，病区人口约2.6亿，是一个严重的公共卫生问题.

氟可透过血－脑屏障在脑中蓄积，进而影响神经系统的结构和功能［8］.学习记忆行为是脑的高级神经行为.动物实验研究表明，学习记忆行为损伤是亚慢性或慢性氟中毒所致脑损伤的主要表现之一［9－10］.但氟致脑损伤的脑内机制还有待于进一步阐明.海马是学习记忆的关键脑区，突触是神经信息传递的关键.因此，本研究在以往工作的基础上，以SD大鼠为动物模型，观测了慢性氟中毒对衰老过程中大鼠开场行为和学习记忆的影响，检测了染氟中期(9月)和染氟结束期(18月)各组大鼠海马CA3区锥体细胞形态学、海马突触体膜流动性和海马 CA3区突触后致密蛋白－95 (PSD－95)表达水平的变化，以期进一步探讨慢性氟中毒致脑损伤的脑内突触机制.

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

初断乳雄性Sprague－Dawley大鼠(清洁级) 192只，体质量65～80 g，购自浙江省实验动物中心(SCYK(浙)2003－0001).随机分成4组，每组48只.对照组饮用自来水(自来水含氟量＜0.2 mg/L)，低氟组、中氟组和高氟组分别饮用15，30和60 mg/L NaF溶液.饲养室采用空调和自动排风装置保持通风，室温15～25℃，湿度40%～70%.实验期间大鼠自由饮水和进食标准饲料(含氟量＜0.2 mg/kg).

1.2 器材和主要试剂

开场行为观测圆场;水迷宫行为分析系统(TSE System GmbH，德国);NaF和苦味酸均购自金华试剂公司.酶标仪(DNM－9606酶标仪)，Olympus光学显微镜(日本)等.

分离液和缓冲液按文献报道的方法配制.

16－DSA(美国Sigma公司);BCA试剂盒(碧云天生物技术研究所);4%多聚甲醛(武汉博士德生物工程有限公司);鼠抗PSD－95单克隆抗体(一抗，美国Santa Cruz);生物素化羊抗小鼠IgG (二抗，武汉博士德生物工程有限公司);SABC试剂盒、DAB显色试剂盒和PBS(武汉博士德生物工程有限公司).

1.3 行为观测

1.3.1 开场行为

按照文献［11］报道的方法对各组大鼠进行开场行为观测，每3月测试一次.指标有1 min和3 min内跑动穿越格数、站立(包括悬空站立、扶壁站立)频率、理毛频率及粪便粒数.比较各组大鼠在新异环境中的自发活动及探究行为.

1.3.2 Morris水迷宫

参照文献［12］用Morris水迷宫实验检测各组大鼠的空间学习记忆力.

1.4 脑海马突触体各项指标检测

1.4.1 突触体膜的制备

分别在染氟中期与染氟结束后断头处死部分大鼠，迅速分离海马，称质量后用剪刀剪成碎片，用分离液清洗干净，再进行匀浆.参照文献［13］的方法制备突触体膜，最后用BCA法测定突触体的蛋白浓度.

1.4.2 突触体膜流动性的测定

用自旋标记(ESR)法［14］测定突触体膜流动性.参照文献［15］，所得图谱见图1.按式(1)计算旋转相关时间，按式(2)、式(3)计算序参数:

图1 16－DSA标记的脑突触体膜ESR波谱

1.4.3 脑海马CA3区锥体细胞形态的观察和PSD－95表达水平的测定

染氟中期(9月)与染氟结束后(18月)断头处死部分大鼠，迅速取出海马脑段，于4%多聚甲醛中固定24 h后，梯度乙醇溶液脱水、透明、石蜡包埋，冠状连续切片，片厚5 μm，HE染色［16］和PSD－95蛋白免疫组织化学染色［17］.

1.4.4 图像分析

在Olympus显微镜下观察各组常规HE切片和PSD－95蛋白免疫组织化学切片.每组取6张切片，在400倍光镜下选取3个视野，采用图像分析系统Image－Pro Plus 5.1软件测出其免疫反应产物的光密度.

1.5 统计学处理

采用SPSS 15.0软件进行数据统计分析，测定值用平均值±标准误(±s)表示.各组均数进行方差齐性检验(homogeneity of variances)，若方差为齐性，则采用单因素方差分析并进行事后检验(Post－hoc test，LSD法进行两两比较).以P＜0.05为具有统计显著性，P＜0.01为差异极显著.

2 结果

2.1 行为观测结果

2.1.1 慢性氟中毒对大鼠开场行为的影响

开场行为的跑动格数反映动物的兴奋性，扶壁/悬空站立频率反映其在新异环境中的探究行为，理毛次数反映其对新异环境的满意程度，粪便颗粒数反映其紧张程度.观测结果如图2所示.

与同组3月龄比较:9月龄中氟组大鼠的3 min跑格数显著减少(P＜0.05);9和15月龄中氟组、12月龄高氟组大鼠的扶壁站立频率显著降低(P＜0.05);18月龄高氟组大鼠的扶壁站立频率极显著降低(P＜0.01);各组的粪便颗粒数和理毛频率随着年龄的增加变化不明显.时效关系分析结果表明，随着染氟时间的延长，氟暴露对开场行为各指标影响的数量和程度均增加.

图2 慢性氟中毒对不同月龄大鼠开场行为的影响

与同龄对照组比较:12月龄中氟组大鼠、9和12月龄高氟组大鼠的1 min跑格数显著性减少(P＜0.05);6和9月龄中氟组及9，12和18月龄高氟组大鼠的3 min跑格数显著减少(P＜0.05); 18月龄高氟组大鼠的扶壁站立频率极显著降低(P＜0.01);12月龄中氟组及9，12和18月龄高氟组大鼠的悬空站立频率显著降低(P＜0.05);各染氟组大鼠的粪便颗粒数与理毛频率没有出现规律性的变化.结果表明，氟中毒对开场行为的影响与染氟浓度基本呈正相关性.

2.1.2 慢性氟中毒对大鼠空间学习记忆能力的影响

逃避潜伏期是大鼠从入水开始直至找到平台所需的时间，逃避潜伏期越短，说明学习记忆力越强.图3表明，除了低氟组18月龄大鼠平均逃避潜伏期显著低于同组3月龄大鼠(P＜0.05)外，对照组、低氟组各年龄段大鼠平均逃避潜伏期变化不明显.中氟组、高氟组大鼠随着年龄的增加平均逃避潜伏期呈逐渐递增的趋势.其中:与同组3月龄大鼠相比，中氟组15月龄、18月龄和高氟组15月龄大鼠平均逃避潜伏期显著升高(P＜0.05);高氟组18月龄大鼠平均逃避潜伏期极显著升高(P＜0.01).结果表明，慢性氟中毒致大鼠逃避潜伏期呈增龄性延长.

与同龄对照组相比，除3月龄大鼠外，各染氟组大鼠平均逃避潜伏期均高于同龄对照组，9和18月龄高氟组大鼠平均逃避潜伏期显著升高(P＜0.05).量效关系分析结果表明，慢性氟中毒大鼠逃避潜伏期与氟暴露浓度成正比.3月龄对照组大鼠平均逃避潜伏期反而高于各染氟组，推测可能是对照组内个体差异太大的缘故.

图3 慢性氟中毒对不同月龄大鼠平均逃避潜伏期的影响

大鼠平均游泳路程见图4.平均游泳距离越短，说明大鼠学习记忆能力越强.与同组3月龄比较:6月龄高氟组、18月龄低氟组和中氟组大鼠的平均游泳路程显著增大(P＜0.05);18月龄对照组、9月龄中氟组大鼠的平均游泳路程极显著增大(P＜0.01).说明在衰老过程中，各组大鼠平均游泳路程总体上呈增龄性递增趋势.

图4 慢性氟中毒对不同月龄大鼠平均游泳路程的影响

与同龄对照组相比，各染氟组平均游泳路程均高于同龄对照组，其中:9月龄低氟组、15月龄中氟组和18月龄高氟组大鼠平均游泳路程差异显著(P＜0.05);9月龄中氟组及3月龄、9月龄高氟组大鼠平均游泳路程差异极显著(P＜0.01).提示慢性氟中毒对大脑产生了毒性效应，加剧了学习记忆能力的增龄性降低趋势，这与上述大鼠平均逃避潜伏期的结果一致.

空间探索实验用于测量大鼠的记忆保存力，以访问平台次数为指标，次数越多说明大鼠记忆能力越强.撤除平台后，各组大鼠访问原平台位置的次数见图5.与同组3月龄比较，9，12，15和18月龄大鼠访问平台次数极显著减少(P＜0.01)，说明各组大鼠访问平台次数呈增龄性下降.

图5 慢性氟中毒对不同月龄大鼠空间探索的影响

与同龄对照组比较，不同年龄段大鼠访问平台次数随着染氟浓度的升高呈递减趋势，其中: 3，6和9月龄各染氟组大鼠访问平台次数显著减少(P＜0.05);12，15和18月龄高氟组大鼠访问平台次数极显著减少(P＜0.01).

2.2 慢性氟中毒对大鼠脑海马突触形态和生化指标的影响

2.2.1 对大鼠海马突触体膜序参数的影响

16－DSA标记的图谱见图1，由图1测量和计算出的序参数(S)值见图6.S代表氮氧自由基附近类脂分子的有序性，S值增大说明膜脂有序性增高，膜流动性降低.由图6可以看出，各组S值随着大鼠年龄的增加而增大，即膜流动性降低，说明自然衰老也可影响突触体膜流动性.与染氟中期(9月)比较，染氟结束时(18月)中氟组与高氟组大鼠的海马突触体膜流动性明显降低(P＜0.05)，提示高氟对膜流动性的影响更显著.

与对照组比较，无论是染氟中期(9月)或染氟结束时(18月)，大鼠突触体膜流动性均随着染氟浓度的增加呈递减的趋势.染氟中期中氟组大鼠的海马突触体膜流动性显著下降(P＜0.05);染氟结束时，与对照组相比，中氟组、高氟组大鼠海马突触体膜流动性极显著下降(P＜0.01).值得注意的是，9月龄大鼠高氟组海马突触体膜序参数值不升反降，基本回到低氟组的水平.

图6 不同月龄大鼠16－DSA标记各组海马突触体膜序参数

2.2.2 对大鼠海马突触体膜τc的影响

由图1(16－DSA标记图谱)测量和计算出的旋转相关时间(τc)见图7.旋转相关时间增加，表明膜脂的微观黏度升高，膜流动性降低;反之，膜流动性升高.图7表明:各组旋转相关时间呈增龄性升高;分别与9月龄中氟组和高氟组相比，中氟组、高氟组18月龄大鼠的旋转相关时间均呈极显著升高(P＜0.01).说明衰老本身可降低突触体膜流动性.

突触体膜的旋转相关时间随着染氟浓度的增大呈递增趋势.与同龄对照组相比:9月龄中氟组突触体膜的旋转相关时间显著升高(P＜0.05); 18月龄低氟组突触体膜的旋转相关时间显著升高(P＜0.05)，中氟组、高氟组突触体膜的旋转相关时间极显著升高(P＜0.01).

图7 不同月龄大鼠16－DSA标记各组海马突触体旋转相关时间

2.2.3 对大鼠海马CA3区锥体细胞形态的影响

如图8和图9所示，HE染色后，400倍光镜下可见:对照组大鼠海马神经元排列整齐，形态规则，细胞界限清晰，多有突起，胞质丰富，核大而圆，核仁清晰;但中氟和高氟组大鼠海马锥体细胞分布较稀疏，细胞轮廓消失，细胞出现空泡.

图8 慢性氟中毒对9月龄大鼠海马锥体细胞形态的影响

图9 慢性氟中毒对18月龄大鼠海马锥体细胞形态的影响

2.2.4 对大鼠海马CA3区PSD－95表达的影响

PSD－95免疫产物为细小棕褐色颗粒，弥散分布，表达于神经元胞体和突起.在海马，PSD－95分布于CA1～CA4区锥体细胞及树突、齿状回(DG)区颗粒细胞层.从图10和图11可见，对照组和低氟组海马CA3区细胞膜染色深，中氟组和高氟组染色浅.光密度(IOD)测定结果显示，随着氟浓度的增大，光密度值呈递减的趋势.

图10 9月龄大鼠海马CA3区PSD－95免疫反应产物(×400)

图11 18月龄大鼠海马CA3区PSD－95免疫反应产物(×400)

图12 氟中毒对大鼠海马CA3区PSD－95免疫反应产物光密度的影响

图12表明，各组大鼠海马CA3区PSD－95表达水平明显呈增龄性升高.与同龄对照组相比: 9月龄高氟组与18月龄中氟组大鼠海马CA3区PSD－95表达水平显著降低(P＜0.05);9月龄中氟组与18月龄高氟组的PSD－95表达水平极显著降低(P＜0.01).

3 讨论

作为动物的一种自发性和探究性活动，开场行为主要反映了动物在新异环境中神经系统兴奋性的变化.氟作为一种蓄积性毒物，可透过“血－脑”屏障在脑内蓄积，达到一定量时就会对神经系统产生毒性，影响脑的许多生理功能，包括智力发育与学习记忆能力.有研究表明，高氟能抑制大鼠自发性神经活动，使其自我协调能力下降、摄食减少等［18］.本实验结果提示，慢性氟中毒对大鼠神经系统兴奋性有一定的影响，抑制了大鼠在新异环境中的自发活动，且随着染毒时间的延长，这种影响更为明显.

许多研究表明，饮用水氟含量与婴幼儿和儿童的智商呈反比［10，19］.动物实验结果也表明，慢性氟中毒不仅对亲代大鼠学习记忆能力有影响，还可通过胎盘屏障使子代大鼠学习记忆能力显著下降［20］.本研究表明，慢性氟中毒损伤大鼠空间学习记忆力，且损伤程度呈增龄性递增.此外，尽管低氟组氟浓度(15 mg/L)略高于正常标准饮用水的氟水平，但结果仍显示其对大鼠的大脑产生了神经毒性，这与以往的研究结果［21］一致.

自旋标记(ESR)法［22］用于检测膜脂深层部位的流动性.细胞膜流动性主要受磷脂烃链长短和脂肪酸饱和度的影响，其变化往往在一般形态学和生物化学改变之前就能观察到，是研究疾病过程细胞早期损伤的高灵敏性分析指标.本研究结果表明，慢性氟中毒会降低大鼠脑突触体膜流动性，且降低程度呈增龄性增加.以往的研究结果已表明，影响膜流动性的重要因素为细胞膜中不饱和脂肪酸含量［23］.因此，慢性氟中毒会降低突触体膜流动性的机制可能是:氟作为电负性最强的元素，极容易获得1个电子成为F－，F－较为活泼，可产生自由基［24］，膜上不饱和脂肪酸易被自由基攻击形成脂质过氧化产物丙二醛，丙二醛可以和膜上蛋白、脂类、糖类等结合，降低膜流动性.此外，本实验结果中9月龄高氟组大鼠突触体膜流动性与9月龄中氟组比较不降反升的现象，说明氟对大鼠突触体膜流动性的剂量效应关系至少不是“直线型”，至于是否属于“抛物线型”还是“S型”还有待于进一步研究确定(在毒理学试验中，环境毒物对机体损害作用的剂量效应关系存在直线型、抛物线型和S型3种基本类型).本研究有关对照组18月龄大鼠海马突触体膜流动性低于9月龄大鼠，提示神经细胞膜流动性降低与衰老也有关.这与文献［25］研究结果一致.

海马是与学习记忆行为相关的脑区，突触是神经信号传递的关键结构，易受年龄、环境等因素影响.动物研究结果已表明，氟中毒可使脑海马突触后致密物质(PSD)厚度和突触活动带长度等显著变化［26］.Shiyaraiashankara等［27］观察了在饮水中含100 mg/L NaF环境下成长的胎鼠、新生鼠及出生后10周大鼠，其脑内海马、皮层、小脑等处均发生神经细胞变性，表现为细胞膜褶皱、线粒体膨胀、染色质固缩等，这与本实验慢性氟暴露可使大鼠海马锥体细胞出现一些明显的病理性变化的结果相一致.

实验证明，慢性氟中毒兔脑组织中可溶性蛋白、碱性蛋白和总蛋白含量显著降低［28］;而且mRNA含量的明显降低，可降低蛋白质合成率.Mubeen等［29］报道，氧化应激所致颅脑外伤可消耗抗氧化系统，导致机体氧化与抗氧化水平失衡和突触相关蛋白表达发生变化.PSD－93和PSD－95是膜相关鸟苷酸激酶(membrane－associated guanylate kinases，MAGUK)家族蛋白，PSD－95是其中一个主要蛋白，存在于所有皮层结构中，包括小脑皮层、大脑皮层和海马等，分布在神经元胞体和神经树突近端［30］.功能性突触可塑性形成需要神经递质受体突触后位点被准确簇集和正确激活.文献［31］的研究显示，PSD－95与NMDA受体在突触后位点准确蔟集和精确定位有一定的关系.PSD－95和GKAP(与PSD－95相关的蛋白)首先形成一个突触后的骨架，随后谷氨酸受体亚单位附着于骨架上，共同调节突触的活动.此外，PSD－95对K+通道簇集和定位及信号传导均有特异性调节作用.PSD－95与学习记忆、突触可塑性等生理过程和缺血、缺氧等病理损伤密切相关［32］.已有研究发现，脑缺血导致PSD－95蛋白表达显著下降［33］.文献［34－35］的研究已表明，氟暴露显著影响PSD－93和PSD－95的表达水平.本实验研究结果进一步提示，大鼠海马CA3区PSD－95表达水平随着染氟浓度的增加逐渐降低，PSD－95表达的降低可减少NMDA受体的数量，从而影响神经信息传递，最终损伤大鼠的学习记忆力.本研究所观测的海马突触体各项指标中，唯有PSD－95表达的增龄性变化与氟暴露递增性影响不一致，表明氟暴露对PSD－95表达水平影响的量效和时效关系有待于进一步研究.

总之，慢性氟中毒致脑海马突触体膜流动性和突触后致密物PSD－95表达水平的改变，可能是慢性氟中毒致学习记忆行为损伤的脑内突触机制之一.

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(责任编辑 薛 荣)

The synaptic mechanism of learning-memory injury induced by chronic fluorosis in brain

ZHANG Zigui， SUN Yan， ZHENG Xiangren

(College of Chemistry and Life Sciences，Zhejiang Normal University，Jinhua Zhejiang 321004，China)

The synaptic mechanism of learning－memory injury induced by chronic fluorosis in brain was investigated.192 Sprague－Dawley(SD)male rats，one－month－old，were randomly divided into four groups and given 15，30，60 mg/L NaF solution and tap water respectively for 18 months.Behavior of rats was evaluated by open field and Morris Water Maze test every 3 months.The hippocampal synaptic membrane fluidity was detected by electron spin resonance，the expression level of post synaptic density 95(PSD－95)in hippocampal CA3region was detected by immunohistochemistry.Results showed that in rats with chronic fluorosis compared with the controls，locomotor activity and exploratory behavior were significantly or very significantly suppressed，spatial learning and memory ability were significantly declined;synaptic membrane fluidity and the protein level of PSD－95 of hippocampus were greatly decreased.The data indicated that the changes of synaptosome membrane fluidity and PSD－95 expression level in hippocampus might be the one synaptic mechanism of learning－memory injury induced by chronic fluorosis in brain.

chronic fluorosis;hippocampus;PSD－95;learning and memory ability;membrane fluidity

B845;R965

A

1001－5051(2015)01－0001－08

�:2014－11－03;

2014－11－07

国家自然科学基金资助项目(81273015);浙江省自然科学基金资助项目(Y2100431)

章子贵(1960－)，男，浙江武义人，教授.研究方向:污染生态学;生理心理学.

10.16218/j.issn.1001－5051.2015.01.001