徐晓虹， 竹庆杰， 杨艳玲， 阮 琴

(浙江师范大学化学与生命科学学院生态研究所，浙江金华 321004)

出生前后DEHP暴露对小鼠神经行为的影响*

徐晓虹， 竹庆杰， 杨艳玲， 阮 琴

(浙江师范大学化学与生命科学学院生态研究所，浙江金华 321004)

研究了增塑剂邻苯二甲酸二(2－乙基)己酯(di－(2－ethyl hexyl)phthalate，DEHP)围生期母体暴露对青春期(6周龄)和成年后部(12周龄)子代小鼠行为的影响.母鼠从妊娠第7天至断乳前(产后21 d)灌胃染毒DEHP(10，50和200 mg/(kg·d))，同时设空白对照组及溶媒对照组.出生后第6和第12周时分别检测仔鼠的活动性、焦虑、空间记忆等行为.结果显示:DEHP暴露显著抑制了青春期雌、雄仔鼠的活动性，增加了其焦虑状态，且加剧的焦虑状态可延续到成年后的雌鼠;损伤青春期雄鼠的空间学习记忆能力，但对青春期雌鼠和成年后雌、雄仔鼠的空间记忆能力没有影响.以上结果提示，发育期DEHP暴露性别特异性地影响仔鼠的多种神经行为，青春期的情感和记忆能力更容易受影响.

邻苯二甲酸二乙基己酯;焦虑;学习记忆;神经行为

环境内分泌干扰物(environmental endocrine disruptors，EEDs)可干扰机体自身激素的合成、代谢和活动等过程，从而影响机体的生殖发育、神经和免疫等功能活动.邻苯二甲酸酯类(phthalate esters，PAEs)就是一种广泛使用的环境内分泌干扰物，全球每年消耗量超过500万t，大量用于增加塑料制品的柔韧性和耐用性(即增塑剂)，其中邻苯二甲酸二乙基己酯(di－(2－ethylhexyl) phthalate，DEHP)的用量最大，约占总量的40%，被广泛用于塑料、合成橡胶、涂料、黏合剂、化工合成、食品包装盒、医疗用具等领域［1］.DEHP兼有拟雌激素和抗雄激素活性，可干扰体内雌激素和雄激素的正常活动，特别是在组织形成和发育阶段(如妊娠期和新生儿期)的暴露可影响性激素敏感组织的发育和长期功能.因此，DEHP对人类和野生动物的生殖发育毒性已引起人们的广泛关注.

性激素不仅调节机体的生殖发育，对中枢神经系统的发育及其性别分化也有非常重要的调控作用［2］.母体摄入的DEHP及其初级代谢产物单－2－乙基己基邻苯二甲酸酯(MEHP)可通过胎盘和乳汁进入子代体内，加之生命早期未发育完全的血脑屏障使DEHP及其代谢产物很容易进入脑组织［3］.有研究发现，围生期母体DEHP暴露可性别和年龄特异性地影响子代大鼠下丘脑视前区的芳香化酶活性［4］.芳香化酶是将睾酮转化为雌激素的关键酶，其在脑内活性的改变势必影响脑内性激素水平.因此，如果DEHP在妊娠后期和出生后早期这一发育关键时期干扰了性激素对脑发育的调节作用，就有可能影响动物的神经行为发育及其性别分化.然而，目前国内外关于DEHP对非生殖相关神经行为影响的研究很少.已有的少量研究中，动物染毒DEHP的剂量偏大，与人们的实际暴露水平相差甚远.如张晶莹等［5］报道妊娠期暴露于500～1 000 mg/kg DEHP所生子代在跳台和避暗实验中均表现出行为受损.另有报道，在出生后第16～22天这一海马发育的敏感时期DEHP暴露可降低雄性大鼠海马CA3区的轴突标记物水平，减少齿状回和CA3区未成熟和成熟神经元密度［6］.这说明发育中的海马是对DEHP敏感的靶位.海马是与学习记忆和情感等行为密切相关的脑区，其发育受性激素的调控［2］.鉴于以上发现，推测在出生前后这一脑发育的关键时期暴露在相当于人们日常暴露水平的DEHP环境，可能会影响神经行为的发育.本文通过围生期(妊娠期+哺乳期)暴露于低剂量DEHP中对不同性别仔鼠多种神经行为影响的研究，探讨了DEHP影响神经行为发育的特征及其性别差异，为环境内分泌干扰物DEHP的环境安全性评价和神经毒性防治提供科学依据.

1 实验材料和方法

1.1 实验动物及模型制备与分组

清洁级ICR小鼠，雌性(体质量25～30 g)，雄性(体质量30～35 g)，购于浙江省医学科学院实验动物中心.饲养环境昼夜12 h交替，室温22～25℃，湿度50%～60%，食物和水自由摄取.适应环境1周后，每日20:00按雌雄比为1∶1合笼交配，次日清晨检查雌鼠阴道，查到阴栓定为妊娠第0天(GD0)，然后雌雄分笼，母鼠单独饲养.母鼠适应灌胃(蒸馏水0.5 mL/d)1周后，从GD7开始灌胃染毒，至仔鼠出生后第21天(PND21)断乳为止.母鼠随机分为5组，根据欧美制定的DEHP无不良效应极限值(48 mg/(kg·d))并参考人们日常的暴露水平，设3个较低水平DEHP (1 g/mL，纯度＞99%，美国Amresco)染毒组:10，50和200 mg/(kg·d)(药理剂量换算后相当于人的0.81，4.05和16.20 mg/(kg·d))、1个溶媒(＜0.56%吐温80)对照组和1个空白(水)对照组，每组12只母鼠.仔鼠由母鼠哺乳喂养，出生3 d后测量体长，每周称体质量.

出生后第21天(PND21)断乳后，仔鼠与母鼠分开饲养;PND35时雌雄仔鼠分开饲养，每个剂量组分别从每窝中随机选取雌、雄仔鼠各1只组成每组的雌性和雄性仔鼠样本，分别在PND42(青春期)和PND84(成年后)进行行为检测(n=12).之后，小鼠眼眶取血，放射免疫法检测雌性小鼠血清中雌二醇含量和雄性小鼠血清中睾酮含量.最后，断头分离雌性仔鼠的子宫和雄性仔鼠的睾丸，计算生殖器官系数.

1.2 行为测试

每个剂量组雌、雄仔鼠分别在PND 42及PND 84按以下顺序进行各项行为的测试.行为轨迹由带摄像头的小动物行为分析系统(TSE System GmbH，德国)自动记录分析.为防止小鼠在模型中留下气味干扰实验结果，每只小鼠测试后清除粪便，并用酒精棉球擦干，消除气味，然后再进行下一只小鼠的测试.

1.2.1 旷场行为

旷场行为箱为划分成16格的正方形(40cm×40 cm×30 cm)，中央4格定为中央区，其余12格为边缘区.记录小鼠3 min内由底面中心开始跑动穿越的格数、悬空站立和理毛的次数，以及小鼠在中央区域停留的时间，观察小鼠在新异环境中的自发活动和探究意愿.

1.2.2 高架十字迷宫

小鼠高架十字迷宫由2个相对的开放臂(30 cm×5 cm)、2个相对的封闭臂(30 cm× 5 cm×15 cm)和一个连接四臂的中央平台(5 cm×5 cm)组成，距离地面50 cm.测试时记录小鼠在迷宫中5 min的行为表现，包括:1)进入开放臂次数;2)开放臂停留时间;3)开放臂和封闭臂总进入次数;4)中央区域探头次数.开放臂进入次数减少或停留时间缩短表明动物焦虑状态增加;中央区探头次数增多表明动物焦虑状态弱，而探究欲望增强;开放臂和封闭臂总进入次数增加表明动物活动性增加.

1.2.3 水迷宫

Morris水迷宫实验检测动物的空间学习记忆能力.水迷宫为一直径90 cm、高45 cm的黑色圆柱形水池，水深25 cm，水温(25±1)℃，水面下1 cm处有一个直径10 cm的黑色平台.迷宫人为分成4个象限，训练时把小鼠面向其中一个象限的池壁放入水中，小鼠找到平台并在平台上停留15 s后，放回饲养笼内休息30 s，然后进行下一次训练.每次在不同象限将小鼠面壁放入水中.如果小鼠在60 s内找不到平台，就人为把小鼠放到平台上停留15 s.每天连续训练4次，为期4 d.第5天撤离平台后，检测小鼠在原平台所在象限(即目标象限)游泳的时间百分比作为记忆保持能力.

1.3 统计学处理

2 结果与分析

2.1 围生期DEHP暴露对仔鼠生长发育和血清激素水平的影响

围生期10～200 mg/(kg·d)DEHP暴露，不影响母鼠的产仔数及出生3 d仔鼠的体长(见表1);没有明显改变6周龄和12周龄雌、雄仔鼠血清中雌二醇或睾酮的水平，以及子宫或睾丸系数(见表2);但10和200 mg/(kg·d)DEHP显著增加了 6周龄雌鼠的体质量(P＜0.01)，50 mg/(kg·d)DEHP显著增加了12周龄雄鼠的体质量(P＜0.05)(见图 1).表明10～200 g/(kg·d)DEHP不影响母鼠的生殖、雌雄性仔鼠的生殖器官发育及血清中的激素水平.

表1 围生期母体DEHP暴露对母体产仔数及出生3 d仔鼠体长的影响(n=12)

表2 围生期母体DEHP暴露对仔鼠血清性激素水平和生殖器官系数的影响

图1 围生期母体DEHP暴露对子代小鼠体质量的影响

2.2 围生期DEHP暴露对仔鼠旷场行为的影响

正常青春期(6周龄)小鼠的理毛行为表现出性别差异(雌性＞雄性.P＜0.001);围生期200 mg/(kg·d)DEHP暴露显著增加了6周龄雄鼠的理毛次数(P＜0.05)，因而消除了青春期小鼠理毛行为的性别差异;10和200 mg/(kg·d) DEHP暴露显著减少了6周龄雌鼠的站立次数(P＜0.01;P＜0.05.见表3).对成年期小鼠而言，围生期DEHP暴露主要影响雌鼠的开场行为，10和200 mg/(kg·d)DEHP暴露减少了雌鼠的跑动格数(P＜0.05)，增加了其理毛次数(P＜0.01，10 mg/(kg·d)DEHP)，并消除了中央区停留时间的性别差异(见表3).以上结果表明，围生期DEHP暴露可抑制青春期和成年后雌性仔鼠的探究意愿和活动性，增加青春期雄性仔鼠和成年后雌性仔鼠的心理矛盾冲突.

表3 围生期DEHP暴露对仔鼠旷场行为的影响(n=12)

2.3 围生期DEHP暴露对仔鼠高架十字迷宫行为的影响

6周龄正常小鼠开放臂进入次数、停留时间及开放臂和封闭臂总进入次数均存在雌性大于雄性的性别差异(P＜0.05，P＜0.01)，而中央区探头次数表现出雄性大于雌性的性别差异(P＜0.01)，表明青春期的雄鼠比雌鼠具有更高的焦虑状态和更低的运动性;成年后这些性别差异消失.围生期DEHP暴露显著减少了子代青春期雌、雄鼠开放臂进入次数(P＜0.01)和停留时间(P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05)，以及雌鼠的开放臂和封闭臂总进入次数(10 mg/(kg·d)DEHP，P＜0.01);成年后仅50 mg/(kg·d)DEHP暴露显著减少了雌鼠开放臂停留时间(P＜0.05).提示围生期DEHP暴露可减少青春期雌性仔鼠的活动性，促进雌、雄仔鼠的焦虑状态，并消除这些行为的性别差异;但DEHP仅加剧成年后雌鼠的焦虑状态(见图2).

图2 围生期DEHP暴露对子代小鼠高架十字迷宫行为的影响

2.4 围生期DEHP暴露对仔鼠水迷宫行为的影响

在4 d水迷宫训练中，无论6周龄或12周龄的各组雌雄仔鼠，游泳速度没有明显的差异，但每天到达平台的平均潜伏期逐渐缩短，说明各组小鼠都具有一定的空间学习和记忆能力.与溶媒对照组相比:50和200 mg/(kg·d)DEHP暴露显著延长了6周龄雄鼠在第3和第4天航行训练中搜索平台的潜伏期(P＜0.05;P＜0.05.见图3);第5天撤离平台后，50 mg/(kg·d)DEHP暴露显著减少了6周龄雄鼠在目标象限(原平台所在象限)的停留时间(P＜0.05.见图3);但DEHP对6周龄雌鼠和12周龄雌、雄仔鼠的搜索潜伏期和目标象限停留时间均无显著的影响.提示围生期DEHP暴露主要损伤青春期雄鼠的空间学习记忆能力，对青春期雌鼠和成年后雌雄仔鼠的记忆行为没有显著的作用.

3 讨论

胚胎后期和出生后早期是动物神经行为形成及其性别分化的关键时期，此时脑内雌激素和雄激素水平是影响行为性别分化的关键因素［7］.因此，在此时期环境内分泌干扰物极易影响动物行为的性别分化.目前国内外关于DEHP对非生殖相关神经行为影响的研究很少，且研究结果也不一致.本研究通过几种模型检测了围生期DEHP暴露对仔鼠多种行为的影响，发现低水平DEHP暴露不影响母鼠的产仔数，对仔鼠的生长发育也没有明显的作用，但性别特异性地影响了仔鼠的活动性、情感和空间记忆等神经行为的发育及其性别分化，这些影响甚至可以延续到成年后.

图3 围生期DEHP暴露对子代小鼠水迷宫航行训练和目标象限停留时间的影响

在旷场行为测试中，DEHP暴露增加了6周龄雄鼠和12周龄雌鼠的理毛次数.理毛是动物在冲突处境下无所适从而表现出的一种转移行为［8］，增加理毛频率提示DEHP可加剧动物在新异环境下的焦虑情绪.但DEHP对小鼠的探究意愿和活动性表现出明显的性别差异，雌鼠6周龄时的站立次数和12周龄时的跑动格数减少，而雄鼠无明显变化，表明雌鼠的活动性和探究意愿对围生期DEHP暴露比较敏感.目前国内外有关DEHP对动物旷场行为影响的报道很少，有研究发现:1 350 mg/(kg·d)DEHP暴露4周显著延长成年雄性大鼠在旷场的运动距离及中央区停留时间［9］;1 000 mg/(kg·d)DEHP暴露8周明显延长雄性小鼠在旷场中心区域的停留时间［10］，表明成年时期 DEHP暴露增加雄鼠的活动性.而Tanaka等［11］发现，暴露于0.03%DEHP(相当于171 mg/(kg·d))的雌、雄小鼠所生雄性子代3周龄时活动性减弱.另有报道，生后5 d暴露于DEHP可诱发青春期雄性大鼠多动症，夜间活动性增加［12］.人群流行病学研究表明，学龄儿童尿液中PAEs代谢物含量与注意缺陷多动症(attention deficit hyperactivity disorder)呈正相关［13］;与智商成负相关［14］.Yolton等［15］测定了美国350名孕妇在孕16周和26周时尿液中的PAEs含量，并与其所产婴儿5周岁之前的健康状况进行比对，发现孕26周尿液含较高水平DEHP的孕妇所生男婴反射功能抑制.综合以上来自啮齿类和人群的研究结果，提示DEHP对活动性和探究意愿的影响存在性别差异，但影响结果可能因暴露时期和剂量而不同.

动物的焦虑状态受性激素的调节并表现出一定的性别差异.总的来说，女性比男性更容易患焦虑症.本研究在开场行为测试中也发现青春期雌鼠比雄鼠的理毛次数更多，表现为更焦虑.但由于诱导焦虑的因素很多，这种性别差异有时并不完全一致.高架十字迷宫主要检测动物对高空的恐慌性焦虑状态.在这一任务中，发现青春期雄鼠比雌鼠表现出更高的焦虑性.这与Gioiosa等［16］在高架十字迷宫上检测小家鼠的结果一致.本研究发现，围生期DEHP暴露的青春期雌、雄仔鼠的焦虑状态均加重，且雌鼠成年后仍然保持高的焦虑水平，而雄鼠成年后的焦虑状态减缓，表明青春期小鼠的焦虑行为对DEHP更敏感，成年后虽然DEHP已消除，但仍然影响雌鼠的焦虑状态.这一结果与前面开场行为测试中DEHP增加6周龄雄鼠和12周龄雌鼠的理毛次数相一致，因为理毛行为增加代表动物处于较高的焦虑水平.目前有关DEHP对焦虑行为影响的研究很少.Carbone等［17］报道出生后 第1～45天 暴露于 30 mg/(kg·d)的DEHP减少了青春期雄鼠在高架十字迷宫中进入开放臂的次数和停留时间，但对雌鼠没有影响.这与本实验的结果不一致，可能的原因与DEHP暴露时期不同有关.胚胎期和新生儿期是脑和行为发育的关键期，本实验的小鼠从母鼠妊娠期开始DEHP暴露，直到哺乳期结束，而文献［17］是从出生后才开始DEHP暴露.

本研究还检测了围生期DEHP暴露对仔鼠空间记忆行为的影响，发现DEHP延长6周龄雄鼠在水迷宫中寻找平台的时间，并减少了其在目标象限的停留时间;但对雌鼠没有影响.表明DEHP对空间学习记忆的影响也有性别差异，其中雄性更敏感.曾有报道妊娠期DEHP暴露损伤子代大鼠的被动回避和空间记忆，但这些研究中DEHP暴露的剂量较大(500～1 000 mg/kg)，且行为检测时没有区分性别，无法评估DEHP损伤子代记忆的性别差异［5，18－19］.另有报道，成年雄鼠暴露于DEHP 10 d(50 mg/kg)或 8周(500～1 000 mg/kg)后水迷宫空间记忆受损［10，20］;但初断乳雄性大鼠暴露于10～1 000 mg/kg DEHP 30 d空间记忆能力没有变化［21］.文献［22］检测了另一种PAEs——邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate，DBP)围生期暴露的记忆效应，发现添加1%DBP饲喂的母鼠其雄性子代大鼠5周龄时空间学习和参考记忆增强，但添加0.037%DBP时却出现抑制效应，而雌性仔鼠不受影响.本研究还发现，围生期DEHP暴露不影响12周龄雌、雄仔鼠水迷宫记忆行为，提示围生期DEHP暴露对青春期空间记忆的影响较显著，而对成年后空间记忆行为的远期影响较小.

许多研究均发现，发育中的脑对环境内分泌干扰物更敏感.令人感兴趣的是，有人发现DEHP对与行为密切相关的海马结构的影响也存在雄性更敏感的性别差异.Smith等［6］报道在出生后第16～22天这一海马发育的敏感时期暴露于DEHP，降低了雄鼠海马CA3区的轴突标记物水平和未成熟与成熟神经元密度，对雌鼠海马没有影响.这可能可以解释青春期雄鼠更容易受DEHP损伤的原因.青春期是从发育到成年的过渡阶段，性激素仍参与脑结构的发育，并影响行为的性别分化［23－24］.因此，推测围生期DEHP暴露主要损伤青春期情感和记忆行为可能与其干扰性激素对青春期海马结构的调节有关.成年后，随着生殖器官的发育成熟，来自性腺的性激素对脑结构和功能的作用日渐完善，加之发育早期(断乳后)脱离DEHP环境，DEHP对成年脑和行为的影响因此逐渐减弱.但与实验动物限定的暴露期不同，人类和野生动物长期甚至终生暴露于DEHP中，因此，DEHP对人和野生动物的远期神经毒性尚需进一步研究.

本研究中母鼠 DEHP暴露剂量为10～200 mg/(kg·d)，根据药理和毒理剂量换算，相当于人体暴露于0.81～16.2 mg/(kg·d)的DEHP，远低于DEHP不影响人体健康的极限值(NOAEL，48 mg/(kg·d))，该剂量的DEHP虽然不影响母鼠的生殖功能和仔鼠的生长发育，但可以影响仔鼠的多种神经行为及其性别分化.人类长期暴露于DEHP环境中，低剂量DEHP对人群脑发育的健康风险不容忽视.

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(责任编辑 薛 荣)

Effects of utero and lactational exposure to di-(2-ethylhexyl)phthalate on neurobehavior of offspring mice

XU Xiaohong， ZHU Qingjie， YANG Yanling， Ruan Qin

(Institute of Ecology，College of Chemistry and Life Sciences，Zhejiang Normal University，Jinhua Zhejiang 321004，China)

The present study investigated the effects of utero and lactational exposure to DEHP(10，50，and 200 mg/(kg·d))from gestation day 7 through postnatal day 21 on the behavior of offspring mice at age of 6 and 12 weeks.The results showed that DEHP exposure significantly inhibited locomotion but increased anxiety－like state of pubertal offspring mice of both sexes，and permanently influenced anxiety－like state of females in adulthood.Utero and lactational exposure to DEHP impaired spatial learning and memory function in pubertal male mice，but not in pubertal females and adult mice of both sexes.These results suggested that developmental DEHP exposure sex specifically influenced a variety of neurobehavior，and anxiety and memory of puberty were more susceptible to DEHP.

di－(2－ethylhexyl)phthalate;anxiety;learning memory;neurobehavior

R395.4

A

1001－5051(2015)01－0015－08

�:2014－10－28;

2014－11－05

徐晓虹(1963－)，女，浙江永康人，教授，博士.研究方向:神经生物学;环境内分泌干扰物的神经毒性.

10.16218/j.issn.1001－5051.2015.01.003