雷冬梅，张 玲，楚天骄，李晓文，肖 海

1)郑州大学第三附属医院病理科 郑州450052 2)漯河医学高等专科学校医学生物学教研室 漯河462002 3)郑州大学基础医学院细胞生物学与医学遗传学教研室 郑州450052 4)郑州大学人民医院河南省医学遗传研究所 郑州450002

SP-D 基因定位于10q22．2-23．1，与甘露糖结合蛋白和SP-A 基因相邻［1］。目前SP-D 基因研究［2］大多集中于氨基酸残基11 密码子(SP-D11)和氨基酸残基160 密码子(SP-D160)多态性在肺部感染性疾病中的作用。已经发现众多严重慢性和炎症性肺部疾病患者血清中SP-D 水平升高，如间质性肺炎、急性呼吸窘迫综合征、特发性肺纤维化、囊性纤维化和嗜酸性肺炎等［3-4］。有研究［2］表明SP-D160 位点单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)与溃疡性结肠炎有关。Floros 等［5］研究发现在墨西哥人群中，SP-D11 位点等位基因C 是肺结核的危险性因素，SP-D160 位点则与肺结核发病无关。关于SP-D11 和SP-D160 位点SNP 与肺结核易感性之间的关系，国内尚无报道。作者通过对河南汉族人群中SP-D11 和SP-D160 位点SNP 进行研究，以期从分子水平上分析SP-D 与肺结核的相关性，探究河南汉族人群肺结核的易感基因。

1 对象与方法

1．1 研究对象 肺结核组:为2010年至2012年收集的197例来自河南新乡、安阳及郑州市结核病防治所的肺结核患者，男88例，女109例，年龄(36．5 ±15．3)岁，＜45岁136例，≥45岁61例;诊断均符合国家统一标准［6］，排除糖尿病、使用激素及免疫力低下的个体。对照组200例，男90例，女110例，年龄(32．1 ±14．6)岁，＜45岁134例，≥45岁66例，均为正常个体。以上研究对象之间无血缘关系，并均得到本人或监护人知情同意。

1．2 SP-D11 和SP-D160 位点SNP 检测 抽取研究对象的静脉血3 mL，EDTA 抗凝，酚-氯仿抽提法提取基因组DNA，应用引物特异性PCR(SSP-PCR)法进行检测。引物序列(表1)来源于GenBank 和相关文献［7］，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，同时设立内对照引物APC 和HLA-DRB1 作为质控引物。PCR 反应体系:模板DNA 2 μL，Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，补充去离子水至20 μL。PCR 扩增条件:96℃预变性1 min;96℃20 s，70℃45 s，72℃25 s，5个循环;96℃25 s，65℃50 s，72℃30 s，21个循环;96℃30 s，60℃55 s，72℃120 s，4个循环;4℃保存。20 g/L 琼脂糖凝胶电泳:取PCR 产物8 μL 加入样品孔，120 V 稳压电泳45 min。在凝胶成像仪紫外灯下观察结果并保存图像。

1．3 基因型判读 琼脂糖凝胶电泳中相邻2个泳道为同一样本的2种不同特异性引物的扩增体系，若2 份扩增体系均有目的条带出现，则该样本为杂合基因型;若仅有1 份体系扩增出目的条带，则说明样本为该特异性扩增引物的纯合基因型。SP-D11位点扩增产物长度为200bp，质控条带为800 bp;SP-D160 位点扩增产物长度为577 bp，质控条带为200 bp。每个SNP 位点的3种基因型扩增产物各抽取2例，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

表1 引物序列

1．4 统计学处理 应用SHEsis 软件http://analysis．bio-x．cn/myAnalysis．php 在线分析数据，并进行基因单倍型分析。应用SPSS 10．0 进行统计学分析，采用χ2检验比较2组基因型频率和等位基因型频率的差异，并计算比值比(OR 值)和95%置信区间(CI)，检验水准α=0．05。

2 结果

197例肺结核患者和200例正常对照者全部得到明确的基因型，SP-D11 位点有3种基因型CC、CT 和TT，SP-D160 位点有3种基因型AA、AG 和GG(图1、2)，测序结果与电泳结果完全一致。SPD11 和SP-D160 位点等位基因频率及基因型频率分布和年龄分层分析结果见表2～7。

图1 SP-D11 T/C 位点各基因型电泳图

图2 SP-D160 A/G 位点各基因型电泳图

表2 SP-D11 基因型和等位基因在肺结核组和对照组的分布例(%)

表3 SP-D11 SNP 在肺结核组和对照组≥45岁人群中的比较例(%)

表4 SP-D11 SNP 在肺结核组和对照组＜45岁人群中的比较例(%)

表5 SP-D160 基因型和等位基因在肺结核组和对照组的分布例(%)

表6 SP-D160 SNP 在肺结核组和对照组≥45岁人群中的比较例(%)

表7 SP-D160 SNP 在肺结核组和对照组＜45岁人群中的比较例(%)

3 讨论

结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病之一，可累及全身多个脏器，但以肺结核最为常见［8］。最近的研究［9］表明:SP-D 不仅可以识别和清除肺内异物和凋亡细胞，而且在降低炎症反应、抑制自身抗体的产生等方面也有重要作用。基因多态性可引起蛋白结构和功能上的改变，导致结核分枝杆菌感染者的不同转归，即不同个体对肺结核表现出不同的易感性［10］。该研究中SP-D 基因的2个SNP 位点均可能发生错义突变，这些错义突变可引起SP-D 蛋白结构和功能的改变，从而决定不同人群对肺结核的易感性不同。

因我国肺结核患者在45岁以下人群中明显增多，故该研究以45岁为节点进行年龄分层分析。研究结果显示，SP-D11 位点CC、TT 基因型在肺结核组中的分布频率均低于对照组，CT 基因型在肺结核组中的分布频率则高于对照组，且与年龄无关，表明该位点的基因型频率与河南汉族人群肺结核发病有关。推测该基因不是肺结核发病的主基因，而只是在复杂的遗传方式中起了较微弱的作用。

作者对SP-D160 位点进行基因型频率与基因频率分析，总体人群分析结果显示其与河南汉族人群肺结核发病无关。但按年龄分层分析结果显示，45岁以下人群A 等位基因在肺结核组的分布频率高于对照组，提示此位点与45岁以下河南汉族人群肺结核发病有关，A 等位基因可能是河南汉族中青年人群肺结核发病的危险因素。目前国内外暂无SPD160 位点SNP 与肺结核之间相关性的报道，因此有必要扩大样本量，进一步确定SP-D160 位点A 等位基因与肺结核的关系。

［1］Crouch E，Rust K，Veile R，et al．Genomic organization of human surfactant protein D(SP-D):SP-D is encoded on chromosome 10q22．2-23．1［J］．J Biol Chem，1993，268(4):2976

［2］Hilgendorff A，Heidinger K，Bohnert A，et al．Association of polymorphisms in the human surfactant protein-D(SFTPD)gene and postnatal pulmonary adaptation in the preterm infant［J］．Acta Paediatr，2009，98(1):112

［3］Glas J，Beynon V，Bachstein B，et al．Increased plasma concentration of surfactant protein D in chronic periodontitis Independent of SFTPD genotype:potential role as a biomarker［J］．Tissue Antigens，2008，72(1):21

［4］Honda Y，Kuroki Y，Matsuura E，et al．Pulmonary surfactant protein D in sera and bronchoalveolar lavage fluids［J］．Am J Respir Crit Care Med，1995，152(6 Pt 1):1860

［5］Floros J，Lin HM，García A，et al．Surfactant protein genetic marker alleles identify a subgroup of tuberculosis in a Mexican population［J］．J Infect Dis，2000，182(5):1473

［6］中华人民共和国卫生部．肺结核门诊诊疗规范:2012年版［J］．中国医学前沿杂志:电子版，2013，5(3):73

［7］Pantelidis P，Lagan AL，Davies JC，et al．A single round PCR method for genotyping human surfactant protein(SP)-A1，SP-A2 and SP-D gene alleles［J］．Tissue Antigens，2003，61(4):317

［8］Alavi SM，Bakhtiyariniya P，Albagi A．Factors associated with delay in diagnosis and treatment of pulmonary tuberculosis［J］．Jundishapur J Microbiol，2015，8(3):e19238

［9］Shrive AK，Martin C，Burns I，et al．Structural characterisation of ligand-binding determinants in human lung surfactant protein D:influence of Asp325［J］．J Mol Biol，2009，394(4):776

［10］肖海，杨洪毅，张照婧，等．河南汉族肺结核患者PTPN22 基因多态性检测［J］．郑州大学学报:医学版，2013，48(2):207