杨 露，张楠楠，张彦婷，李庆华，许 尧，朱相展，#，关方霞1，#

1)郑州大学生命科学学院 郑州450001 2)郑州大学第一附属医院干细胞研究室 郑州450052

Ets 家族是最大的信号依赖转录因子家族，通过调节细胞的增殖、分化、凋亡及上皮-间充质的相互作用，参与许多生理和病理过程［1］。Ets2 为Ets 转录因子家族成员之一。近年来，越来越多的研究［2-3］表明，Ets2 的表达与肿瘤的发生发展密切相关。研究［4］发现，Ets2 在不同肿瘤组织中的表达水平存在差异，如在肺癌组织中低表达，而在乳癌组织中高表达。食管鳞状细胞癌(简称食管鳞癌)是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，预后差，其发病机制尚不十分清楚。目前，关于Ets2 对食管鳞癌细胞的影响报道较少，仅有研究［5］显示Ets2 在食管鳞癌组织中表达上调。该实验观察了Ets2 在多个食管鳞癌细胞株中的表达情况，并通过RNA 干扰技术沉默Ets2的表达，分析Ets2 下调对食管鳞癌细胞增殖、侵袭能力以及细胞周期的影响，从而探讨Ets2 在食管鳞癌发生发展中的作用机制。

1 材料与方法

1．1 材料 食管上皮细胞Het-1A 及食管鳞癌细胞系EC1、Eca109、EC9706 购自中国科学院上海生物所细胞库。RPMI 1640 细胞培养基、胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶(美国HyClone 公司)，SYBR®Premix Ex Taq®(Tli RNaseH Plus)(大连宝生物工程有限公司)，Ets2 多克隆抗体(美国Santa Cruz 公司)，GAPDH、E-cadherin、Caspase-3、Bcl-2 等多克隆抗体和细胞全蛋白提取试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)，LipofectamineTM2000(美国Invitrogen 公司)，CCK-8 细胞增殖检测试剂盒(日本同仁化学研究所)，EdU 细胞增殖检测试剂盒(广州锐博生物有限公司)，Cell Invasion Assay Kit EC550(美国Chemicon 公司)，PI/RNase Staining Buffer 和Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit Ⅰ(美国BD 生物科学公司)。

1．2 4种细胞中Ets2 蛋白表达的检测 Het-1A、EC1、Eca109、EC9706 细胞均使用含体积分数10%FBS 的RPMI 1640 培养基于37℃、体积分数为5%CO2的条件下培养。细胞培养至对数生长期后，应用Western blot 法检测Ets2 蛋白。提取细胞总蛋白，采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，湿转电转移法转膜后用50 g/L 脱脂奶粉溶液室温封闭2 h，加入Ets2 多克隆抗体(稀释度1∶500)，4℃过夜孵育，加入相应二抗(稀释度1∶1 000)，37℃孵育1 h，以GAPDH 作为内参蛋白，用eECL 发光液曝光，胶片经扫描仪扫描后进行灰度分析。实验重复3次。

1．3 EC9706 细胞分组与处理 实验所用siRNA片段由上海吉玛公司设计、提供，共3 对干扰片段。预实验筛选出的有效片段序列正义链:5'-GCAG CAACUUGAAUUUGCUTT-3'，反 义 链:5'-AGCAAA UUCAAGUUGCUGCTT-3'。将EC9706 细胞分为阴性对照组(NC组)，空白对照组(CON组)，转染试剂对照组(lip2000组)和Ets2 siRNA组(siRNA组)。严格按照LipofectamineTM2000 说明书进行细胞转染，转染完成后将细胞培养板置于37℃、体积分数5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养，4 h后将含转染复合物的培养基弃去，重新加入新鲜培养基置于培养箱中培养48 h，然后进行相关的检测。

1．4 E-cadherin、Caspase-3 和Bcl-2 蛋白检测 细胞按1．3 分组处理后，采用Western blot 法检测3种蛋白的表达，具体操作同1．2。一抗为E-cadherin 多克隆抗体(1∶1 000)，Caspase-3 多克隆抗体(1∶400)，Bcl-2多克隆抗体(1∶400)。实验重复3次。

1．5 EC9706 细胞增殖的检测 ①EdU 荧光标记法检测细胞增殖。细胞分组同1．3。向培养板中加入EdU 溶液，室温孵育2 h，PBS 洗涤。40 g/L 多聚甲醛固定30 min，甘氨酸溶液孵育5 min，PBS 清洗，然后用含体积分数为0．5% TritonX-100 的PBS 漂洗。加入Apollo®染色反应液，室温、避光孵育30 min，甲醇和PBS 分别清洗2次。最后加入Hoechst 33342 反应液，室温、避光孵育30 min，荧光显微镜下观察染色细胞。400 倍视野下选取3个视野，计数EdU 染色细胞(增殖细胞)和Hoechst 33342 染色细胞(总细胞)，细胞增殖率=增殖细胞数/细胞总数×100%。实验重复3次。②CCK-8 方法检测细胞增殖。细胞分组同1．3，且每组设置3个复孔。转染完成后，培养48 h，倒掉旧培养基，每孔加入100 μL 新鲜培养基和10 μL CCK-8 溶液。然后将其置于37℃、体积分数5% CO2培养箱中孵育2 h，在酶标仪450 nm 波长处读取各孔的吸光度(A)值。计算细胞增殖抑制率，增殖抑制率= ［(对照孔A值－实验孔A 值)/(对照孔A 值－空白孔A 值)］×100%。实验重复3次。

1．6 EC9706 细胞侵袭能力检测 采用Transwell法。细胞分组同1．3。取300 μL 37℃预热的无血清培养基加入到Transwell 小室的上室中，在37℃培养箱中孵育1．5 h，使ECM 膜水化;弃去培养基，将300 μL 细胞悬液(细胞密度为2 ×105mL－1)加入到上室，并将500 μL 含体积分数10% FBS 的新鲜培养基加入到下室;在培养箱中培养24 h 后，取出小室用棉球轻轻擦除上表面未迁移的细胞，向下室中加入500 μL 染色液染色20 min，然后用PBS 清洗3次，最后在显微镜下观察，取9个高倍视野计数迁移细胞，计算平均值。

1．7 EC9706 细胞周期检测 收集同1．3 分组转染后48 h 的细胞，用PBS 洗2次，预冷的体积分数70%的冰乙醇固定，4℃过夜。1 000 r/min 离心5 min，弃去乙醇，PBS 洗2次。用0．5 mL 的PI/RNase Staining Buffer 重悬细胞，室温孵育15 min 后用流式细胞仪检测。实验重复3次。

1．8 EC9706 细胞凋亡检测 采用Annexin VFITC/PI 双染法检测细胞凋亡。用不含EDTA 的胰蛋白酶消化同1．3 分组转染后48 h 的细胞，调整细胞密度为1 ×106mL－1，取1 mL 细胞悬液，PBS 洗2次;用Binding Buffer 重悬细胞，然后向细胞悬液中加入Annexin V-FITC 和PI 各5 μL，轻轻混匀后，避光、室温孵育15 min;向每个处理组中加入400 μL的Binding Buffer，在1 h 内上流式细胞仪检测早期细胞凋亡率。同时每组细胞设置相应的对照组:未染色细胞、Annexin V-FITC 单染细胞、PI 单染细胞、Annexin V-FITC/PI 双染细胞。实验重复3次。

1．9 统计学处理 采用SPSS 17．0 处理数据。4种细胞中Ets2 蛋白表达，4组EC9706 细胞中E-cadherin、Caspase-3 和Bcl-2 蛋白表达，细胞增殖率，增殖抑制率，迁移细胞数，细胞周期分布及早期凋亡率的比较均采用单因素方差分析，两两比较采用LSDt 检验。检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 Het-1A、EC1、Eca109 和EC9706 细胞中Ets2蛋白的表达 结果见图1、表1。与正常食管上皮细胞Het-1A 相比，食管鳞癌细胞EC1、Eca109 和EC9706 中Ets2 蛋白的表达均升高，其中EC9706 细胞中的表达量最高，因此选择EC9706 细胞进行后续实验。

图1 Het-1A、EC1、Eca109和EC9706 细胞中Ets2 蛋白的表达

表1 不同细胞中Ets2 蛋白的表达

2．2 4组EC9706 细胞增殖的比较 EdU 法检测结果见图2、表2。图2 中红色荧光代表增殖细胞，蓝色荧光代表总细胞。CCK-8 法检测结果见表2。上述2种方法的检测结果表明siRNA组细胞增殖率降低，增殖抑制率升高。

2．3 4组EC9706 细胞侵袭能力的比较 Transwell侵袭实验结果见图3、表2。结果显示，siRNA组EC9706 细胞的侵袭能力降低。

表2 4组EC9706 细胞增殖、侵袭能力比较

2．4 4组EC9706 细胞周期的比较 见表3，由表3可知，Ets2 沉默的EC9706 细胞周期无明显变化。

表3 4组EC9706 细胞的周期分布 %

图2 EdU 法检测4组EC9706 细胞增殖(×400)

图3 4组EC9706 细胞的侵袭能力(×400)

2．5 4组EC9706 细胞凋亡及3种蛋白表达的比较结果见表4，由表4 可知，siRNA组EC9706 细胞早期凋亡率升高。Western blot 检测E-cadherin、Caspase-3和Bcl-2 蛋白表达变化的结果见图4、5 和表5，结果显示，与NC组相比，siRNA组中E-cadherin 和Caspase-3蛋白表达量增加，而Bcl-2 蛋白表达量减少。

表4 4组EC9706 细胞早期凋亡率比较 %

图4 4组EC9706 细胞E-cadherin 蛋白的表达

图5 4组EC9706 细胞Caspase-3 和Bcl-2 蛋白的表达

表5 4组EC9706 细胞中E-cadherin、Caspase-3、Bcl-2 蛋白的表达

3 讨论

转录因子Ets2 广泛存在于各种细胞和组织中，但是在不同的细胞中其功能具有较大的差异性。Ets2 通过蛋白之间的相互作用或者信号介导通路参与调节细胞增殖、分化、周期和凋亡等［6］。研究［7］表明，Ets2 还参与调节胚胎血管的生成。同时，Ets2为许多信号通路的下游分子，如PI3K/AKT、Ras/Raf/MAPK 以及Ca2+依赖的有丝分裂信号通路等［8］。目前，在许多肿瘤组织中均发现了Ets2 的异常表达［9-10］，Ets2 表达失调或者与其他蛋白融合参与了许多肿瘤事件的发生。Foulds 等［11］发现Ets2对肿瘤细胞及正常细胞的生长起不同的作用。在Ras 介导癌性转化的NIH3T3 细胞中，高表达Ets2能逆转已发生癌性转化的NIH3T3 细胞，使细胞趋于恢复正常的细胞形态。这与之前报道的Ets2 高表达能够促进NIH3T3 细胞成瘤相矛盾［12］。在肺癌中亦发现针对相同细胞系，Ets2 既有致癌基因活性又有抑癌基因活性［8］。

由于Ets2 在肿瘤发生发展中的作用尚存在争议，该研究检测了其在食管上皮细胞Het-1A 和食管鳞癌细胞EC1、Eca109、EC9706 中的表达情况，实验结果支持Ets2 在肿瘤细胞中表达上调的观点，且Ets2 在EC9706 细胞中的表达量最高。为研究Ets2在食管鳞癌发展中的作用，该实验通过RNA 干扰技术下调EC9706 细胞中Ets2 的表达，结果发现，当Ets2 表达下调后，EC9706 细胞的增殖能力和侵袭能力显著下降，黏附因子E-cadherin 的表达升高;细胞早期凋亡比例增加，推测为Ets2 下调可下调抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达，激活Caspase-3，从而促进细胞凋亡;但细胞周期无明显变化。以上实验证明Ets2表达下调能有效抑制食管鳞癌的发展，为进一步研究Ets2 在食管鳞癌中的生物学功能，解决其是抑癌基因或癌基因的争议提供了实验基础。Shiota 等［13］发现，Ets2 能够调节Prdx1 的表达，且与Prdx1 表达呈正相关。该实验室前期实验［14］证明，抑制Prdx1表达能够阻断mTOR/p70S6K 信号通路。由此，初步推断转录因子Ets2 可能通过调节mTOR/p70S6K信号途径参与食管鳞癌的发展过程，Ets2 可能成为食管鳞癌诊断的分子标志物和治疗靶点。

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