许林平，张瑞芳，王 鹏，张建营

1)郑州大学附属肿瘤医院;河南省肿瘤医院科研外事办 郑州450008 2)新乡医学院公共卫生学院实验室管理办公室 新乡453003 3)郑州大学公共卫生学院流行病学教研室;河南省肿瘤流行病学重点实验室 郑州450001

众多研究［1-2］发现肿瘤患者血清中存在各种类型的抗细胞自身抗原的抗体，其中与肿瘤发生有关的抗原被称为肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)。对血清TAA 的检测可以用于肿瘤的早期诊断，但单一抗原在肿瘤患者中出现的频率较低，一般在10%～20%，所以仅采用一项TAA 诊断肿瘤价值十分有限，而通过联合、使用一组“精心筛选”的TAA组合就可克服该缺点［3-4］。不同肿瘤可能需要不同的TAA组合，因此多种TAA 联合检测用于肿瘤早期诊断具有可行性和实用性。该研究对不同类型肿瘤患者进行了8种TAA(Koc、p62、IMP1、cyclinE、p16、survivin、c-myc、p53)检测，并评价检测结果，探讨TAA组合检测在肿瘤诊断中的价值。

1 材料与方法

1．1 血清标本 304 份不同类型肿瘤患者(98例肺癌、69例食管癌、50例肝癌、46例结直肠癌、41例乳癌)和58 份正常人血清标本由大连市中心医院检验科提供。肿瘤患者血清均采集于首次到大连市中心医院就诊、经组织病理学确诊并且没有接受过任何化疗或放疗的患者。正常对照血清采集于到该院正常体检、经查无任何肿瘤相关疾病的健康成年人。

1．2 主要试剂和仪器 8种TAA(Koc、p62、IMP1、cyclinE、p16、survivin、c-myc、p53)由美国德克萨斯州大学生命科学系肿瘤免疫与肿瘤分子流行病学研究室提供;HRP 标记的羊抗人IgG 购自美国Stratagene 公司;四甲基联苯胺(TMB)、过氧化氢尿素、明胶购自美国Sigma 公司;96 孔酶标板购自美国Gibco 公司;SUNRISE 自动酶标仪购自美国Tecan公司。

1．3 血清中8种TAA 抗体的检测及TAA 免疫活性验证 采用ELISA 法［5］测定血清中8种TAA 抗体。8种TAA 分别用包被稀释液稀释成0．5 mg/L，包被96 孔酶标板，每孔100 μL，用30 g/L 明胶封闭2 h;加入一抗待测血清(1∶100 稀释)，以PBS 作为空白对照，每孔100 μL，37℃孵育1 h，PBST 洗板3次;加入HRP 标记的羊抗人IgG 二抗(1∶4 000 稀释)，每孔100 μL，37℃孵育1 h，洗板3次;加入TMB-过氧化氢尿素显色液，每孔100 μL，37℃湿盒加热避光反应至充分显色，加终止液50 μL;在自动酶标仪上读取450 nm 处的OD 值。选择4个正常对照和2个肿瘤患者血清标本用于批间可靠性的判断。结果判定:每份样品血清做2 孔，取平均值为最后结果。设空白孔调零。以58例正常人血清OD值的平均值加2个标准差为判断临界值，高于此值为阳性，低于此值为阴性。将ELISA 阳性反应的血清标本进一步用Western blot 技术验证其对TAA 的免疫活性［6］，操作按照试剂盒说明书进行。

1．4 统计学处理 采用SPSS 17．0 进行统计分析。采用χ2检验或确切概率法对不同组间TAA 阳性率进行比较，检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 单一TAA 检测结果 见表1。肿瘤患者血清中8种TAA 阳性率普遍偏低，最高为肝癌中的cyclinE，阳性率达34．0%;但均高于正常人。

表1 8种TAA 抗体检测结果 阳性数(%)

2．2 不同TAA组合检测结果 以单一TAA 抗体阳性率最高的TAA 为组合检测的起点，以每增加一种TAA 要保证能最大程度地提高检测灵敏度为原则，对不同TAA组合检测进行了分析，见表2。从表2 可以看出，随TAA组合数目的增加直至最终的8种抗原联合，无论哪种肿瘤，阳性率均逐步增加。

2．3 不同TAA组合检测的诊断价值 不同TAA组合诊断价值见表3、表4。结果显示，随着TAA组合种类的增加直至最终的8种TAA组合，对肿瘤的合计诊断灵敏度(Se)从11．5%逐步提高至63．5%，特异度(Sp)从100．0%降至86．2%。不同类型肿瘤诊断的约登指数从一种TAA 的0．049～0．180提高到8种TAA组合的0．423～0．522。预测值也随TAA组合的变化而变化，如8种TAA组合时，不同类型肿瘤诊断的阳性预测值(PPV)为74．2%～88．7%，阴性预测值(NPV)则为58．8%～75．8%。

表2 不同TAA组合检测结果 阳性数(%)

表3 不同TAA组合诊断价值的评价

表4 8种TAA组合的诊断价值

3 讨论

肿瘤发生的多因素、多步骤分子机制为生物标志物用于肿瘤的早期诊断提供了理论支持，但众多研究表明，没有任何单一标志物可以完全识别和区分肿瘤患者和正常人，因此，多个标志物的组合就可能成为肿瘤早期诊断的一种有效方法。肿瘤患者血清中存在有多种抗TAA 的自身抗体，可作为肿瘤发生过程中识别异常或失调细胞机制的早期标志［7］。近十余年来，TAA 作为监测肿瘤发生的早期生物学标志已经得到广泛和深入的研究，尤其多种TAA 的组合在肿瘤诊断中的价值更大［8-10］。

该研究对304 份不同类型肿瘤患者血清中的8种TAA 进行了检测及诊断效能分析，结果显示，单一TAA 对肿瘤的诊断灵敏度普遍较低，从4．9%～18．0%，8种TAA组合对肿瘤的诊断灵敏度升高至56．1%～66．0%;8种TAA组合诊断的阳性似然比达4．60，阴性似然比为0．42，PPV 达96．0%，NPV 达31．1%，说明8种TAA组合检测肿瘤的临床诊断价值较高。结果进一步验证了“精心挑选的多种TAA组合能够大大提高肿瘤诊断的灵敏度”这一观点。

目前有关TAA组合在临床上的实用性研究仍处于起步阶段，在TAA组合广泛应用于诊断肿瘤、监测肿瘤进展、指导肿瘤治疗等方面之前，定义TAA 系统的最优组合、最大限度地提高组合的灵敏度和特异度至关重要。另外，不同肿瘤可能需要不同的TAA组合，以达到早期肿瘤免疫诊断所需要的敏感度和特异度，从而使多种TAA组合检测并用于肿瘤早期诊断具有可行性和实用性。上述问题均需进一步研究探讨。

［1］Tan EM．Autoantibodies，autoimmune disease，and the birth of immune diagnostics［J］．J Clin Invest，2012，122(11):3835

［2］Zhang JY，Tan EM．Autoantibodies to tumor-associated antigens as diagnostic biomarkers in hepatocellular carcinoma and other solid tumors［J］．Expert Rev Mol Diagn，2010，10(3):321

［3］Paradis V，Bedossa P．In the new area of noninvasive markers of hepatocellular carcinoma［J］．J Hepatol，2007，46(1):9

［4］Liu W，Peng B，Lu Y，et al．Autoantibodies to tumor-associated antigens as biomarkers in cancer immunodiagnosis［J］．Autoimmun Rev，2011，10(6):331

［5］陈俊林，王鹏，闫平平，等．肺癌早期诊断12种肿瘤相关抗原微阵列检测分析［J］．中国公共卫生，2012，28(4):479

［6］Ye H，Sun C，Ren P，et al．Mini-array of multiple tumor-associated antigens (TAAs)in the immunodiagnosis of breast cancer［J］．Oncol Lett，2013，5(2):663

［7］Tan EM，Zhang J．Autoantibodies to tumor-associated antigens:reporters from the immune system［J］．Immunol Rev，2008，222:328

［8］Liu W，Wang P，Li Z，et al．Evaluation of tumour-associated antigen(TAA)miniarray in immunodiagnosis of colon cancer［J］．Scand J Immunol，2009，69(1):57

［9］刘会娟，王鹏，闫平平，等．肿瘤相关抗原的抗体检测在原发性肝癌早期诊断中的价值［J］．中国肿瘤临床，2008，35(19):1112

［10］徐莉娟，代丽萍，王凯娟，等．多种肿瘤相关抗原抗体在乳癌早期诊断中的应用［J］．郑州大学学报:医学版，2012，47(2):241